Box-Benhnken响应面法优化超声波辅助提取酸枣多糖工艺研究

贾东升，崔施展，谢晓亮，温春秀，李荣乔，刘铭

（河北省农林科学院经济作物研究所，药用植物研究中心，河北石家庄050051）

Box-Benhnken响应面法优化超声波辅助提取酸枣多糖工艺研究

贾东升，崔施展，谢晓亮*，温春秀，李荣乔，刘铭

（河北省农林科学院经济作物研究所，药用植物研究中心，河北石家庄050051）

利用Box-Behnken响应面法对超声波辅助提取酸枣多糖工艺进行优化。在单因素试验基础上，选择超声波功率、超声时间和液料比为考察因素，以酸枣多糖提取得率为评价指标，采用Box-Behnken响应面法考察各个因素及其交互作用对酸枣多糖提取得率的影响。最佳提取工艺为：超声波功率为360W，超声时间为23 min，液料比为45∶1（mL/g）。在优化提取工艺参数条件下提取3批酸枣，平均提取得率为（4.8±0.69）%（n＝3）。利用Box-Behnken响应面法优化超声波辅助提取酸枣多糖工艺，方法简便，预测性良好。

超声波辅助提取；酸枣多糖；Box-Behnken响应面法

酸枣为鼠李科植物酸枣的干燥成熟果实，原产于中国，多分布于北方。酸枣仁是常用的中药食材，酸枣除去果核的果肉部分仍具有较高的营养价值和保健功能，但酸枣果肉的利用程度较低，造成大量资源浪费。近年来对植物多糖的研究报道日趋增多，多糖具有多种生物活性。目前大量的药理实验结果证明，酸枣多糖具有提高机体免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗溃疡、抗血栓形成、抗突变，改善睡眠，增强机体耐缺氧能力，清除自由基，抑制肿瘤等多种活性[1-2]，是现代养生的重要食材。

超声波辅助提取作为一种先进的提取方法，通过超声波对细胞壁产生的破碎效应，从而可以提高了提取成分的效率。由于超声波提取工艺较传统的热提取工艺具有提取效率高、操作方便、无需加热等优点，已广泛应用于植物多糖的提取[3-5]。本试验以酸枣多糖提取得率为评价指标，在超声功率、超声时间和液料比3个单因素试验基础上，利用响应面法优化超声波提取酸枣多糖的工艺参数，为开发利用酸枣果肉资源及工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

JY92-Ⅱ超声细胞破碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；BP-211D电子天平：德国赛多利斯公司；DL-6000B离心机：湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；UV-3紫外可见分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司；CFB高速万能粉碎机：北京市长风仪器仪表公司。

1.2 材料与试剂

酸枣（产地：河北邢台）；无水葡萄糖标准品（批号：20140506）：中国药品生物制品检定所；苯酚（分析纯）：华东医药股份有限公司；硫酸（分析纯）：华东医药股份有限公司；苯酚（分析纯）：上海凌峰化学试剂有限公司；蒸馏水（自制）。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

取105℃烘干至恒重的无水葡萄糖标准品2.0 g，精密称定，蒸馏水定容至100 mL，配制成含20.0 mg/mL的葡萄糖标准储备溶液。精密移取葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.5、1、2.0、5.0 mL 置于 100 mL 容量瓶，加蒸馏水定容，配制成含 0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1.0 mg/mL 系列葡萄糖标准溶液。分别移取上述系列葡萄糖标准溶液各2 mL，另取2 mL蒸馏水作空白试验，置20 mL具塞玻璃试管中，分别加入5%苯酚溶液1 mL，迅速加入浓硫酸5 mL，充分涡旋，冷却至室温，在490 nm波长处测定溶液的吸光度值。得回归方程：A＝0.008 3C-0.0031，r＝0.9999，表明葡萄糖在 0.005mg/mL～0.25mg/mL范围内浓度与吸光度值呈良好的线性关系。

1.3.2 酸枣多糖的超声波辅助提取工艺

取干燥去核酸枣果肉，粉碎后过100目筛，得到酸枣果肉干粉。称取适量酸枣干粉，加入到适量纯化水浸泡2 h，转移到超声波提取器中，按照不同条件进行超声波辅助提取。将提取后的样品溶液转移到离心机3 000 r/min，离心10 min进行分离，得到酸枣多糖提取液。

1.3.3 酸枣多糖含量测定

参照文献[6]采用苯酚-硫酸法测定酸枣中多糖含量。具体步骤如下：取2 mL酸枣多糖提取液置20 mL具塞玻璃试管中，加入5%苯酚溶液1 mL，迅速加入浓硫酸5 mL，充分涡旋，冷却至室温，在490 nm波长处测定溶液的吸光度值。将测得的吸光值带入标准曲线方程，计算得到酸枣多糖浓度，将酸枣多糖浓度带入下式计算得酸枣多糖提取得率。

酸枣多糖提取得率/%＝（CV×稀释倍数）/M×100

式中：C为测得吸光度对应的浓度，mg/mL；V为提取液的体积，mL；M为酸枣干粉重量，mg。

1.3.4 单因素试验

按照“1.3.2”项下提取工艺进行酸枣多糖提取，以酸枣多糖提取得率为考察指标，分别对影响提取工艺的因素（超声波功率、超声时间、液料比）进行单因素试验，考察提取工艺中的各因素对酸枣多糖提取得率的影响。其中，超声波功率选取 100、200、300、400、500、600 W 6 个水平，超声时间选取 5、10、15、20、25、30、35、40、45 min 9 个水平，液料比选取 20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1（mL/g）6 个水平。

1.3.5 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，选取超声波功率（X1，W）、超声时间（X2，min）和液料比（X3，mL/g）为自变量，酸枣多糖提取得率（Y，%）为响应值，采用 Box-Benhnken响应面法对酸枣多糖的提取工艺进行优化，并且按最佳提取条件进行验证试验。因素水平见表1，工艺优化试验安排及结果见表2。

表1 试验设计水平表Table 1 Variables in the Box-Behnken design

2 结果与讨论

2.1 超声波辅助提取酸枣多糖的单因素试验

2.1.1 超声波功率对酸枣多糖提取得率的影响

固定液料比为40∶1（mL/g），超声波提取时间为25 min的条件下，分别按超声波功率为100、200、300、400、500、600 W 6个水平提取酸枣多糖，计算酸枣多糖提取得率，结果如图1所示。

图1 超声波功率对酸枣多糖提取得率的影响Fig.1 Effects of ultrasonic power on extraction rate of Wild jujube Polysaccharides

由超声波功率对酸枣多糖提取得率的影响结果表明，随着超声功率的增大，酸枣多糖提取得率呈逐渐增加趋势，在400 W时多糖提取得率出现峰值。继续增加超声功率，多糖提取得率反而下降，因此需要对超声功率进一步优化。

2.1.2 超声时间对酸枣多糖提取得率的影响

固定液料比为40∶1（mL/g），超声波功率为400 W的条件下，分别按超声时间为 5、10、15、20、25、30、35、40、45 min 9个水平提取酸枣多糖，计算酸枣多糖提取得率，结果如图2所示。

图2 超声时间对酸枣多糖提取得率的影响Fig.2 Effects of ultrasonic time on extraction rate of Wild jujube Polysaccharides

由超声时间对酸枣多糖提取得率的影响结果表明，随着超声提取时间的增加，酸枣多糖提取得率呈现逐渐增加的趋势，在20 min时多糖提取得率出现峰值。继续延长超声时间，多糖提取得率几乎不变。

2.1.3 液料比对酸枣多糖提取得率的影响

固定超声波功率为400 W，超声波提取时间为25 min 的条件下，分别按液料比选取20∶1、30∶1、40∶1、50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1（mL/g）6 个水平提取酸枣多糖，计算酸枣多糖提取得率，结果如图3所示。

图3 液料比对酸枣多糖提取得率的影响Fig.3 Effects of liquid-solid ratio on extraction rate of Wild jujube Polysaccharide

由液料比对酸枣多糖提取得率的影响结果表明，随着液料比的降低，酸枣多糖提取得率出现先增加后降低的趋势，在液料比为40∶1（mL/g）时，酸枣多糖提取得率出现峰值，因此需要对液料比进一步优化。

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果

在单因素试验基础上，以酸枣多糖提取得率（Y，%）为因变量，选取超声波功率（X1，W）、超声时间（X2，min）和液料比（X3，mL/g）为自变量，采用三因素三水平的Box-Benhnken响应面法进一步优化酸枣多糖提取得率（Y，%），试验设计及响应值结果见表2。

采用“Design expert 7.0”试验设计软件，对表2试验数据进行处理，以评价因变量分别对各自变量进行方程回归拟合及方差分析，结果见表3。

表2 Box-Behnken试验设计表与响应值Table 2 Box-Behnken experiment design independent（X）and dependent variables（Y）

表3 回归方程中系数的显著性检验Table 3 Significance test of coefficient in regression equation

对表3中试验数据进行回归拟合，得到酸枣多糖提取得率对所选3个因素的二次多项回归方程为：Y＝4.67-0.11X1+0.076X2+0.063X3+0.20X1X2-0.025X1X3+0.050X2X3-1.17X12-0.70X22-0.73X32

对数据进行处理，结果表明，方程的模型显著（P＜0.05），说明模型有意义；失拟差不显著（P＞0.05），说明模型与试验值的差异较小，该模型拟合程度良好，可以用回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析和预测。表3中一次项X1、X2和X3水平均显著（P＜0.05）；交互作用项 X1X2、X1X3和 X2X3水平不显著（P＜0.05）；二次项 X12、X22、X32水平均极显著（P＜0.01）。

2.2.2 响应面分析图

考察所拟合的响应曲面的形状，分析超声功率、超声时间和液料比对酸枣多糖提取得率的影响，等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。各因素之间的交互作用对酸枣多糖提取得率影响的等高线见图4～图6。

图4 自变量X1，X2与因变量Y的等高线图Fig.4 Contour plot showing the effect of the X1and X2on extraction rate of Wild jujube Polysaccharide

图5 自变量X1，X3与因变量Y的等高线图Fig.5 Contour plot showing the effect of the X1and X3on extraction rate of Wild jujube Polysaccharide

由图4可知，表明超声波功率和超声时间的交互作用对酸枣多糖提取得率影响较大。从等高线形状可以看出，在液料比为恒定值的条件下，随着超声波功率的增加，多糖提取得率先增大后减小，在中心点处出现峰值；随着超声时间的增加，多糖提取得率先增大后减小，在中心点处出现峰值。

图6 自变量X2，X3与因变量Y的等高线图Fig.6 Contour plot showing the effect of the X2and X3on extraction rate of Wild jujube Polysaccharide

由图5可知，表明超声波功率和液料比的交互作用对酸枣多糖提取得率影响较大。从等高线形状可以看出，在超声时间为恒定值的条件下，随着超声波功率的增加，多糖提取得率先增大后减小，在中心点处出现峰值；随着液料比的增加，多糖提取得率先增大后减小，在中心点处出现峰值。

由图6可知，表明超声时间和液料比的交互作用对酸枣多糖提取得率影响较大。从等高线形状可以看出，在超声波功率为恒定值的条件下，随着超声时间的增加，多糖提取得率先增大后减小，在中心点处出现峰值；随着液料比的增加，多糖提取得率先增大后减小，在中心点处出现峰值。

2.2.3 优化工艺参数验证

以酸枣多糖提取得率最大值为目标，根据“Design Expert 7.0”试验设计软件得最优超声波辅助提取工艺参数为：超声波功率360 W，超声时间23 min，液料比45∶1（mL/g）。按照“1.3.2”项下超声波辅助提取工艺，以优化后的工艺参数提取酸枣多糖。3批酸枣多糖平均提取得率为（4.8±0.69）%（n＝3），试验观测值与模型预测值偏差为3.69%，可知，试验观察值和模型预测值比较接近，说明模型预测性良好。

3 结论

以酸枣多糖提取得率为考察指标，通过对酸枣多糖提取条件的单因素考察和响应面分析，得到超声波提取酸枣多糖的最佳工艺条件为：超声波功率360 W，超声时间 23 min，液料比 45∶1（mL/g），以优化后的工艺参数提取酸枣多糖。结果显示，3批酸枣多糖平均提取得率为 4.8%±0.69%（n＝3）。

超声波的作用机制主要包括机械破碎和空化作用[7-8]。超声波在介质传播过程中，引起介质质点的交替压缩和伸张，这种作用能显著地增大溶剂进入提取物细胞的渗透性，加强传质过程，从而强化了提取效率；当介质处于稀疏状态时，介质会被撕裂成很多小的空穴，这些空穴一瞬间闭合，闭合时产生瞬间高压，即称为空化效应，这种空化效应可加速待测物中的有效成分进入到提取液中，增加有效成分的溶出。

超声波提取技术应用于酸枣多糖的提取，具有提取效率高、提取时间短，更重要的是提取过程避免加热，从而防止因高温对酸枣多糖分子结构的破坏，是酸枣多糖实现工业化提取较为理想的一种提取新工艺，对充分利用酸枣资源有现实参考意义。

[1] 郎杰.酸枣多糖的提取及对免疫功能影响的初探[J].食品研究与开发,2013,34(4)：35-69

[2] 杨军胜,刘晓桓.酸枣保健饮料的研制[J].食品研究与开发,2012,33(2)：95-97

[3] 张彬,谢明勇,殷军艺,等.响应面分析法优化超声提取茶多糖工艺的研究[J].食品科学,2008,29(9)：234-238

[4] 张君萍,侯喜林,董海艳,等.响应曲面法优化超声波提取沙葱籽多糖工艺[J].食品科学,2011,32(2)：98-103

[5]王慧娜,赵桦.响应面法优化开口箭多糖超声提取工艺研究[J].食品工业科技,2012,33(13)：187-192

[6] 赵洪梅,孙君,尹德斌,谢春阳.响应面优化超声波提取猴头菇多糖工艺研究[J].农产食品科技,2011,5(4)：11-15

[7] 朱国辉,丘泰球,黄卓烈.超声波在萃取中的应用[J].声学技术,2001,20(40)：188-190

[8] 赵旭博,董文宾.超声波技术在食品行业应用新进展[J].食品研究与开发,2005,26(1)：3-7

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Process of Wild jujube Polysaccharide Based on Box-Benhnken Response Surface Methodology

JIA Dong-sheng，CUI Shi-zhan，XIE Xiao-liang*，WEN Chun-xiu，LI Rong-qiao，LIU Ming
（Institute of Cash Crops of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Centre of Medicinal Plant Research，Shijiazhuang 050051，Hebei，China）

To optimize the process of ultrasonic-assisted extraction technology of Polysaccharide from Wild jujube using Box-Benhnken response surface methodology.The single-factor extraction tests and response surfaceanalysis were employed to optimize the technological conditions，including ultrasonic power，ultrasonic time and liquid/solid ratios.The experiment results indicated that the optimal extraction conditions were ultrasonic power of 360 W，ultrasonic time 23 min，liquid/solid ratios 45 ∶1（mL/g），respectively.Under these conditions，3 batchs Polysaccharide from Wild jujube were extracted.The average extraction rate of Wild jujube Polysaccharides was （4.8±0.69）%（n＝3）.The ultrasonic-assisted extraction process of Wild jujube Polysaccharides using Box-Behnken response surface methodology was simple and good predictability.

ultrasonic-assisted extraction；Wild jujube Polysaccharides；Box-Behnken response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.010

河北太行山区特色功能保健食品的开发研究（11231005D）

贾东升（1982—），男（汉），副研究员，硕士研究生，主要从事中药功能食品研究。

*通信作者：谢晓亮（1962—），男，研究员，博士，主要从事中药资源、中药加工研究。

2015-03-30