绵羊胚胎不同发育阶段及其组织中MicroRNA-483-5p表达分析

张译元，唐 红，郭延华，王新华，王立民，周 平

(新疆农垦科学院畜牧兽医研究所/新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室，新疆石河子　832000)



绵羊胚胎不同发育阶段及其组织中MicroRNA-483-5p表达分析

张译元，唐 红，郭延华，王新华，王立民，周 平

(新疆农垦科学院畜牧兽医研究所/新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室，新疆石河子832000)

【目的】研究MicroRNA(miR)483-5p在中国美利奴羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织中的表达变化，以了解其在绵羊胚胎发育中的重要作用。【方法】选择中国美利奴羊胚胎不同发育时期(45、85、115和135 d 4个时期)肾脏和脐带组织为研究材料，采用半定量RT-PCR检测第45 d 绵羊胚胎不同组织中miR-483-5p的表达；同时利用实时荧光定量 PCR对miR-483-5p在绵羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织的表达变化进行实时检测。【结果】miR-483-5p在所检测的绵羊45 d胚胎各组织中广泛表达，其中以肌肉、心脏和肺脏组织表达丰度最高。实时荧光定量PCR结果显示，不同发育阶段绵羊胚胎肾脏和脐带组织miR-483-5p的表达具有明显的时空选择性。脐带组织miR-483-5p随着胚胎发育其表达量呈逐渐下降的趋势；肾脏组织miR-483-5p则是随着胚胎发育在第85 d其表达量下降到最低，其后在115和135 d其表达量又逐渐上升。不同发育阶段胚胎肾脏、脐带组织miR-483-5p的表达量呈显著性差异(P<0.05)。【结论】miR-483-5p在绵羊胚胎不同发育阶段肾脏或脐带组织中表达明显不同，表明其表达具有选择性；依据miR-483-5p表达的差异性及其涉及的生物学功能，推测miR-483-5p在绵羊脐带和肾脏组织中具有一定的调控作用。研究为进一步了解miR-483-5p在胚胎肾脏和脐带发育中的作用机制提供一定的理论依据。

绵羊；胚胎；miR-483-5p；表达分析

0　引 言

【研究意义】MicroRNA (miRNA，亦称微RNA) 是一类长约22个核苷酸的小分子非编码RNA。miRNA主要通过与靶基因mRNA的特定位点结合，抑制该蛋白的合成或诱导mRNA的降解，从而参与基因的表达调控[1,2]。miRNA在各种生物中普遍存在，据统计大约有30%左右的功能基因表达受控于miRNA。这些miRNA只在特定的组织表达[3]。自1993年Lee等[4]在线虫中发现第一条miRNA lin-4以来，研究人员陆续从动物的线虫、果蝇(Drosophila)、家鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)以及植物的拟南芥等生物体内发现了超过3 000多种miRNA[1,5,6,7]。这些miRNA的功能不但涉及调控胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢、细胞分化等方面，还与动物生殖，如卵巢生物学过程[8,9]、乳腺[10]、睾丸[11]、肌肉[12]等方面息息相关。miRNAs在动物胚胎发育中可能起到作用有：在不同发育周期的空间和时间上调控某些基因的表达；参与调控雄性生殖细胞的发生过程，尤其是生殖细胞的减数分裂过程；参与胚胎的背腹模式、前后模式、四肢、神经系统的形成等。【前人研究进展】miRNA 483-5p是一类具有重要功能的miRNA。已有研究表明，miR-483-5p调控胰岛素样生长因子2 (亦称生长调节素A) (insulin-like growth factor,IGF2)[13]，IGF2是一种内源性印记基因，其在哺乳动物的胚胎发育过程中起着非常重要的作用。IGF2基因的表达产物IGF2是由前体物质通过蛋白质水解、加工而形成的单链蛋白质，由67个氨基酸组成，是胚胎性生长因子[14]。Ning等[15]研究表明，给予广西巴马小型猪(Guangxi Bama Mini-pig)供体细胞注射TSA和5-aza-dC能够导致IGF2的表达水平显著升高，体细胞与囊胚的DNA甲基化水平显著降低，囊胚的成活率显著提高(由16%提高到25.6%)，提示IGF2可能是胚胎正常发育过程重要的调控因子。Gong等[16]研究显示，超大出生并伴随心脏与肺脏发育异常的克隆牛(Bostaurus)肾脏组织IGF2的表达水平极显著高于正常生理状态的克隆牛，进一步说明IGF2基因与动物胚胎发育正常与否密切相关。Rojas等[17]利用免疫组化技术对发育不良性多囊肾病的人(Homosapiens)胎儿肾脏组织IGF2的表达情况进行了跟踪检测，结果发现，IGF2基因在阻塞性肾脏组织中呈高丰度表达。在小鼠(Musmusculus)中，miR-483-5p主要结合在IGF2基因的第二内含子区并调控此基因的表达[13]。目前有关miR-483-5p的研究与报道主要以疾病治疗等方面为主，至今未见有关哺乳动物miR-483-5p介导胚胎发育机理方面的报道。【本研究切入点】近年来，随着分子技术的不断更新，利用转基因手段进行动物分子育种成为国内外研究热点，但不可忽视的是转基因动物胎儿流产率较高，究其实质是由胎儿和胎盘异常引起的。脐带是连接胎儿与母体的重要通道，是胎儿与母体进行营养和代谢物质的交换中心；肾脏是动物机体重要的排泄器官，在维持机体内环境稳定方面扮演着重要的角色。因此从分子水平研究绵羊胚胎脐带与肾脏的发育机制具有深远的科学实践意义。【拟解决的关键问题】实验室前期通过生物信息学软件筛选出可能与IGF2发生互作的miRNA，结合Ma等[13]的实验结果，推测miR-483-5p可能是影响绵羊胚胎发育的重要候选miRNA。基于此，研究获得了绵羊miR-483-5p成熟体序列；并对其进行组织表达谱分析，同时检测胚胎不同发育阶段绵羊脐带和肾脏组织miR-483-5p的表达变化规律，为进一步了解miR-483-5p在脐带和肾脏中的具体生物学功能积累基础数据。

1　材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 实验动物与样品采集

选择秋季(8月)购买年龄相近(3～4岁)、健康的中国美利奴成年母羊(购于新疆兵团紫泥泉羊场)15只，在新疆农垦科学院种羊场进行统一饲养。待其生理状况稳定后，通过公羊早晚试情并配种，记录配种时间，B超仪结合形态学观察确定羊只妊娠与否。分别于妊娠45、85、115和135 d时手术摘取成年母羊妊娠胎儿各3只，迅速采集其心脏、肝脏、肾脏、肺脏、肌肉以及脐带等组织样品，置于液氮中保存，以供备用。

1.1.2 主要试剂及仪器

Trizol Reagent试剂、M-MLV反转录试剂盒购于Invitrogen公司(美国)；实时荧光定量PCR反应试剂盒(Faster Start Essential DNA Green Master)、LightCycler 480定量仪购于Roche公司(美国)；组织匀浆器(Precellys 24，法国Bertin公司)、核酸蛋白分析仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA合成

按照Trizol Reagent试剂盒说明书提取45 d中国美利奴羊胚胎心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肌肉、脐带等组织与胚胎不同发育阶段(85、115及135 d)肾脏与脐带组织的总RNA。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，核酸蛋白分析仪检测其纯度和浓度。采用Invitrogen公司的M-MLV第一链合成试剂盒制备各样品cDNA。反应体系(20 μL)为：5×第一链合成缓冲液 4 μL，0.1M DTT 2 μL，10 mM dNTP混合物1 μL，模板(总RNA) 2 μg，引物 2 pmol，RNaseOUTTM核酸酶抑制剂1 μL，M-MLV 逆转录酶(200U) 1 μL。按照试剂盒操作说明中的程序进行反转录反应：37℃ 50 min，75℃ 15 min。得到的cDNA置于-20℃保存，以供备用。

1.2.2引物的设计和合成

从miRbase (http://www.miRbase.org)数据库中搜索mus-miR-483-5p成熟体序列设计引物，反转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTCCCTTC-3’；设计miR-483-5p的实时荧光定量PCR上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGAAGACGGGAGGA AAGA -3’，下游引物为通用引物：5’- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC -3’；内参基因为5 s，反转录引物：5’- CTCAACTGGTGTCGTGG-3’，实时荧光定量PCR上游引物：5’- ACACTCCAG CTGGGGAA-3’，下游引物为通用引物(同上)，所有引物均由Invitrogen公司进行合成。

1.2.3 绵羊miR-483-5p成熟体序列的克隆

以反转录得到的第一链cDNA为模板进行RT-PCR扩增，PCR反应体系25 μL，其中cDNA模板1 μL、10×TaqBuffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL、ddH2O 18 μL。PCR循环体系：94℃ 5 min；94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共35个循环；最后72℃延伸10 min。扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳检测条带的大小，并选择目的条带进行切胶回收送交北京华诺时代科技有限公司进行测序。

1.2.4miR-483-5p的组织表达谱

以中国美利奴羊45 d胚胎心脏、肝脏、肾脏、肺脏、肌肉、脐带cDNA为模板进行半定量RT-PCR扩增。①最佳扩增循环数的确定：先以5 s为内参基因进行PCR扩增，产物利用2.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，通过灰度值确定指数扩增期的最佳循环数；②初始模板浓度的确定：根据5 s指数扩增期PCR产物灰度值调整各组织cDNA初始模板浓度，并与miR- 483-5p指数扩增期PCR产物灰度值进行比较；③半定量RT-PCR：PCR反应体系25 μL，其中10×TaqBuffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL、ddH2O 18 μL。PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共30个循环；然后72℃延伸10 min。半定量分析miR-483-5p在不同组织中的相对表达量。

1.2.5miR-483-5p在中国美利奴羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织中的表达变化规律

以中国美利奴羊45、85、115和135 d胚胎的肾脏和脐带组织cDNA为模板，以5 s为内参基因，按照Faster Start Essential DNA Green Master试剂盒操作程序，采用SYBR Green I染料法对miR-483-5p的表达进行实时定量PCR检测。实时荧光定量PCR反应体系20 μL：2×Master Mix 10 μL、cDNA模板 1 μL、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 0.4 μL、ddH2O 8.2 μL，每个样品设3个生物学重复，并设置相应的阴性对照。PCR反应条件：95℃ 5 min、95℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s，共计45个循环；扩增反应结束后进行溶解曲线分析。

1.2.6 数据分析

荧光定量数据分析：以中国美利奴羊45 d胚胎的肾脏和脐带组织miR-483-5p的表达量为1，以持家基因5 s为参照，Ct法(Qr=2-ΔΔCt)分析中国美利奴羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织miR-483-5p的相对表达量。

2　结果与分析

2.1中国美利奴羊miR-483-5p成熟体的扩增

以中国美利奴羊肾脏cDNA为模板，经RT-PCR扩增获得了一条长度为73 bp的序列片段，与预期大小相一致，将该序列与GenBank中公布的miR-483-5p成熟体序列比对发现，是实验所需的目的片段。

2.2 绵羊45 d胚胎不同组织miR-483-5p的组织表达谱

5 s基因在31和32个循环时目的条带亮度基本保持一致，说明扩增已进入平台期，其中在30个循环GAPDH基因以指数形式扩增，因此确定30个循环为扩增循环数。

以5 s为内参基因，利用半定量RT-PCR对中国美利奴羊45 d胚胎的心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肌肉、脐带组织中miR-483-5p表达情况进行了初步检测。结果显示，5 s在各个组织中呈高丰度表达，条带亮度基本一致，可以作为内参来定量miR-483-5p基因的表达。经检测， miR-483-5p在中国美利奴羊45 d胚胎心脏、肝脏、肾脏、肺脏、肌肉、脐带中均有表达。其中，miR-483-5p在心脏、肺脏以及肌肉组织中呈高丰度表达，在肝脏、肾脏和脐带组织中的表达量相对较低；心脏、肌肉、肺脏组织miR-483-5p的相对表达量均极显著高于肝脏、肾脏和脐带组织(P<0.01)。图1

注：小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)，字母相同表示差异不显著(P>0.05)，下同

Note：The different small letters mean the difference atP<0.05, the different capital letters mean the difference atP<0.01, and the same letters means less obvious difference atP>0.05，the same as below

图1绵羊45 d胚胎不同组织miR-483-5p的表达
Fig.1 Analysis of the relative expression of miR-483-5p in different tissues of 45 d sheep embryos

2.3 miR-483-5p在中国美利奴羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织中的表达变化规律

为了进一步了解miR-483-5p对中国美利奴羊胚胎发育的影响，研究对中国美利奴羊胚胎不同发育阶段肾脏与脐带组织miR-483-5p的表达变化情况进行了实时荧光定量PCR检测。研究采用相对定量方法，以5 s为内参基因，并定义miR-483-5p基因在45 d胚胎的肾脏和脐带组织表达水平为1，以便于对miR-483-5p在中国美利奴羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织的表达水平进行相对定量。图2

2.3.1肾脏组织

miR-483-5p在中国美利奴羊胚胎不同发育阶段的表达量由高到低为：135 d>115 d>45 d>85 d，miR-483-5p在45、115和135 d肾脏的表达量呈高丰度表达，在85 d的表达量相对较低；胚胎不同发育阶段肾脏组织间miR-483-5p的表达量呈显著性差异(P<0.05)，45、115和135 d肾脏组织miR-483-5p的表达量显著高于85 d (P<0.05)，而45、115和135 d的表达量无明显差异(P<0.05)。

2.3.2脐带组织

脐带组织miR-483-5p的表达量则是随着天数的增加表达量呈逐渐下降的趋势，其表达量由高到低为：45 d>85 d>115 d>135 d。不同发育阶段脐带组织间miR-483-5p的表达量呈显著性差异(P<0.05)，45 d脐带组织miR-483-5p的表达量显著高于85、115和135 d (P<0.05)，其他三个发育阶段脐带组织miR-483-5p的表达量无明显差异(P>0.05)。

图 2绵羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织中miR-483-5p的表达Fig 2Analysis of the relative expression of miR-483-5p in kidney and umbilical cord tissues of sheep embryos at different developmental stages

3　讨 论

近年来，miRNA已成为生命科学领域研究热点。miRNA是一类广泛存在于生物机体内对基因表达进行微调的小RNA分子。参与机体一系列重要的生命进程，包括：细胞增殖、胚胎发育、细胞凋亡、脂质代谢等，在调控发育中扮演着非常重要的角色[18,19]。这种调控机制主要通过其与靶基因mRNA的3 UTR区结合导致mRNA降解或阻断mRNA实现的。目前有关miRNA的定量表达方法主要有两种：3′端加接头和stem-loop(颈环引物)两种方法，其中颈环引物qRT-PCR由于其快速、简单、准确性高等特点，被广泛地应用于miRNA的表达研究[20]。

已有报道miR-483-5p靶向定位于基因组常染色体11p15.5IGF2基因第二内含子内[13]，了解IGF2基因的功能有助于对miR-483-5p功能的研究，IGF2基因除了参与细胞增殖、细胞生长、肿瘤细胞的增值、肌纤维的分化，还参与大脑的发育、神经的旁分泌和自分泌，此外，IGF2基因是与胚胎发育密切相关的重要调控因子[17,21]。另有研究表明，miR-483-5p能够与MeCP2，FIS1，TGF-β等不同靶标基因结合参与血管形成、炎症反应以及等多种生物学过程[9,13,22,23]。迄今为止，有关miR-483-5p在动物胚胎发育中的研究尚未见到有研究报道，为了解miR-483-5p在中国美利奴羊胚胎不同发育阶段及不同组织中的表达情况，试验进行了初步研究。

研究首次克隆了绵羊miR-483-5p的成熟序列并对其组织表达谱进行了分析。结果显示，miR-483-5p在所检测的45 d绵羊胚胎心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脐带以及肌肉组织中均有表达，其中在心脏、肝脏和肌肉组织中的表达丰度最高，肾脏和脐带组织表达相对较低。Ward 等[25]、Shi等[26]、Li等[24]、Song等[27]、Han等[22]研究表明，miR-483-5p在人的心脏、卵巢、肝脏、肺脏、海马、肾脏等组织中均有表达，与研究结果相近。与在心脏、肝脏和肌肉组织中高表达相反，miR-483-5p在肾脏和脐带组织中表达较低，造成这种原因可能是由于miR-483-5p在45 d胚胎肾脏和脐带发挥调控功能导致，具体功能机制还需进一步的实验论证。

为了进一步了解miR-483-5p对绵羊胚胎发育的影响，研究重点针对中国美利奴羊不同发育阶段胚胎肾脏和脐带组织miR-483-5p的表达情况进行了实时定量PCR检测。结果表明，肾脏组织miR-483-5p随着胚胎发育在第85 d其表达量下降到最低，其后在115 d和135 d其表达量又逐渐上升。不同发育阶段胚胎肾脏组织miR-483-5p的表达量呈显著性差异(P<0.05)。Liu等[28]研究表明，miR-483-5p存在于IGF2的内含子区，并能够与IGF2的5′非翻译区结合以正调控的方式增强胎儿期(成年期不能增强IGF2的转录)其的转录；Hale等[29]研究显示，缺失P2启动子的成年转IGF2基因小鼠，会导致其体内的IGF2量显著降低，继而引发IGF信号通路减弱，最终导致肾小体发生病变；范秀军等[30]认为小尾寒羊(Small tailed han sheep)120 d左右胚胎肾小体发育成熟，结合实验的研究结果，研究推断，miR-483-5p在绵羊胚胎发育后期可能通过调节IGF2基因的转录参与了胚胎期肾脏组织的正常发育。同时研究还发现，脐带组织miR-483-5p随着胚胎发育其表达量呈逐渐下降的趋势，这种表达差异是否与脐带形成初期发育相关还有待进一步研究。另外，由于此次采样仅仅选取了4个胚胎发育阶段，未对其他发育阶段肾脏和脐带样品组织进行检测分析，miR-483-5p确切的生物学功能尚需进一步的实验佐证。

4　结 论

研究获得了绵羊miR-483-5p的成熟体序列，并利用实时荧光定量PCR技术检测了其在中国美利奴羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织中的表达变化规律。miR-483-5p在45、115和135 d肾脏的表达量呈高丰度表达，在85 d的表达量相对较低；胚胎不同发育阶段肾脏组织间miR-483-5p的表达量呈显著性差异(P<0.05)；而在脐带组织miR-483-5p的表达量则是随着天数的增加表达量呈逐渐下降的趋势，不同发育阶段脐带组织间miR-483-5p的表达量呈显著性差异(P<0.05)。研究结果为进一步研究该miRNA在绵羊胚胎脐带和肾脏发育中的功能提供基础数据。

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Fund project:Supported by the National Natural Science Foundation of China (NSFC) (No:31160227), Academician special foundation of XPCC (No.2015AG018), Science foundation for Young Scientists of Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science (No.YQJ201502)

Analysis of the Relative Expression of MicroRNA-483-5p during Different Developmental Stages and Various Tissues of Sheep Embryo

ZHANG Yi-yuan, TANG Hong, GUO Yan-hua, WANG Xin-hua, WANG Li-min, ZHOU Ping

(ResearchInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,XinjiangAcademyofAgriculturalandReclamationSciences/KeyLaboratoryofOvineBreedingBiologyTechnologyofXinjiangProductionandConstructionCorps,ShiheziXinjiang832000，China)

【Objective】 The aim of this study is to detect the expression of MicroRNA (miR) 483-5p in kidney and umbilical cord tissues at different stages of embryos in Chinese Merino and to explore the roles of miR-483-5p in embryonic development. 【Method】In this study, different development periods (45 d, 85 d, 115 d and 135 d 4 times) kidney and umbilical cord tissue of Chinese Merino sheep embryo were taken as the research material, the expression of miR-483-5p in different tissues of 45th day embryos of sheep was analyzed by RT-PCR. On the basis, the expression of miR-483-5p in kidney and umbilical cord tissues at different stages of embryos were analyzed and compared by Real-time PCR.【Result】The results showed that miR-483-5p were widely expressed in the tested tissues, in which the expression level of muscle, heart and lung was much higher than the others. The real-time PCR showed that the expression of miR-483-5p in kidney and umbilical cord tissues at different stages embryos of sheep had obvious temporal selectivity. In the wake of embryo development the expression of miR-483-5p in umbilical cord tissues was gradually decreased, but in kidney tissues, the expression of miRNA 483-5p was declined to the lowest in 85 d of embryonic development, then gradually increased in the 115 d and 135 d. There were significant differences for expression change extent of miR-483-5p in kidney or umbilical cord in different development stages of embryo.【Conclusion】These results suggested that the expression of miR-483-5p in kidney or umbilical cord at different development stages and various tissues of embryos were obviously different, which suggested that miRNA 483-5p was selectively expressed in sheep embryonic development. It was deduced that miR-483-5p had regulation function in kidney and umbilical cord according to the difference of expression and the reported function of miR-483-5p. These results might provide the theoretical basis for further study of mechanism of microRNAs in kidney and umbilical cord of sheep embryo.

sheep; embryo; miR- 483-5p; expression analysis

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.04.025

2015-11-12

国家自然科学基金项目(31160227)；兵团院士资金专项(2015AG018)；新疆农垦科学院青年科学基金(YQJ201502)

张译元(1988-)，女，山东单县人，助理研究员，研究方向为动物体细胞克隆，(E-mail)zhangyiyuan1988@sina.com

王立民(1980-)，男，内蒙古包头人，副研究员，研究方向为绵羊体细胞克隆与胚胎发育，(E-mail)wanglm1980@126.com

S827.1

A

1001-4330(2016)04-0778-07