17α-甲基睾酮对斑马鱼肝脏vtg基因mRNA表达的影响

刘少贞，吕文琪，吕小也

（山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801）

17α-甲基睾酮对斑马鱼肝脏vtg基因mRNA表达的影响

刘少贞，吕文琪，吕小也

（山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801）

为评价17α-甲基睾酮（17α-methyltestosterone，MT）对斑马鱼肝脏vtg基因mRNA表达的影响，利用MT处理斑马鱼雌、雄鱼7 d，采用实时定量PCR（qRT-PCR）检测雌、雄鱼肝脏中vtg基因mRNA的表达量。结果显示，MT处理雌鱼7 d，25 ng/L处理组肝脏vtg基因的表达量显著降低（P＜0.05），50 ng/L和100 ng/L的MT处理组肝脏vtg基因mRNA表达量极显著降低 （P＜0.01）；MT处理雄鱼7 d，25 ng/L处理组肝脏vtg基因mRNA表达量与对照组相比差异不显著 （P＞0.05），50 ng/L的MT处理组肝脏vtg基因mRNA表达量显著升高 （P＜0.05），100 ng/L的MT处理组肝脏vtg基因mRNA表达量极显著升高（P＜0.01）。斑马鱼肝脏vtg基因对MT比较敏感，可以作为监测环境中MT的生物标志物。

17α-甲基睾酮；斑马鱼；肝脏；vtg

环境中的雄激素主要有3个来源：造纸厂生产过程中会产生雄激素，随着造纸厂污水的排放从而进入环境中；污水处理厂会产生一定量的雄激素；农业活动中会有一定量的雄激素排放到环境中［1］。17α-甲基睾酮（17α-methyltestosterone，MT）是天然雄激素睾酮的17-α位甲基衍生物，也是一种重要的环境内分泌干扰物。研究表明，MT能够显著降低底鱂雄鱼体内的睾酮（T）和11-酮基睾酮（11-KT）的含量，并能够显著提高底鱂雌鱼卵巢中芳香化酶基因的表达［1］。雌鱼对MT的敏感程度显著高于雄鱼［2］。MT在鱼类体内会被芳香化成 17α-甲雌二醇，从而发挥雌激素功能［3］。因此，暴露在含有MT环境中的雌鱼，其卵巢中雌激素的分泌量会降低［4］。雄激素在体内的作用机理尚未明确，但由雄激素受体AR介导的外源性激素作用途径被多数学者认可［5］。卵黄蛋白原（vitellogenin，VTG）是卵黄蛋白的前体，其生成是通过下丘脑—垂体—性腺（hypothalamicpituitary-gonadal，HPG）轴激活雌激素受体来实现的［6］。在雄鱼和幼鱼中，VTG的生产可以作为生物标志物来检测环境中的雌激素［7］。该研究利用MT暴露斑马鱼，采用qRT-PCR的方法检测了肝脏vtg基因mRNA表达的变化情况，旨在为阐明MT在斑马鱼体内的作用机理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 斑马鱼成鱼，购自山西省太谷县东苑水族同一批繁殖的4月龄斑马鱼，在实验室暂养2周后进行暴露试验。

1.2 主要仪器和药品 17α-甲基睾酮（Sigma），Trizol Reagent、RACE 试 剂 盒 （Invitrogen），Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas），6×Loading Buffer、Taq DNA 聚合酶（Sigma），dNTP mix、DNA Marker Ladder （DL 2 000）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）。

微量移液器（Eppendorf），VORTEX-6 漩涡混合器 （上海川翔生物科技有限公司），超低温冰箱Fouma 700 SERIES（Thermo），紫外分光光度计（NanoPhotometer），冷冻低温离心机（Pimor），PCR扩增仪（Bio-Rad），实时荧光定量PCR仪。

1.3 MT处理斑马鱼 斑马鱼成鱼在实验室内暂养2周后进行暴露试验，MT暴露分为3个浓度处理组，分别为 25、50、100 ng/L，按 0.001%（V/V）的浓度分别溶解在无水乙醇中，对照组用0.001%（V/V）无水乙醇水溶液处理，MT暴露时间为7 d。每个试验组和对照组各15尾鱼，雌、雄鱼分开暴露。每天定时、定量饲喂饲料。试验组和对照组的8个鱼缸中水的体积均为30 L，采用半静水暴露方法［8］，每天定时更换一半体积的水及相应的暴露物质。光照周期为 14 h/10 h（明/暗），水温控制在（25±2）℃。

1.4 总RNA的提取、检测和反转录 测量MT暴露后斑马鱼的生物学指标，然后进行解剖，取其性腺和肝脏。应用Trizol一步法进行总RNA的提取，利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。反转录按照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，Canada）试剂盒的说明书进行操作。

1.5 qRT-PCR 采用实时荧光定量PCR（qRTPCR）技术检测雌、雄斑马鱼暴露MT 7 d后肝脏中vtg 基因的 mRNA 表达量［9］。

1.6 数据分析 采用 2-ΔΔCt对获得的 qRT-PCR试验数据进行处理。试验结果以Mean±SD表示。运用SPSS统计学分析软件中的单因素方差分析 （Oneway ANOVA）和最小显著差异法（LSD）进行显著性分析，P＜0.05时认为差异显著，P＜0.01时认为差异极显著。

图1 MT暴露7 d后斑马鱼肝脏vtg基因mRNA表达量的变化情况

2 结果与分析

该研究利用qRT-PCR方法检测了斑马鱼雌、雄鱼MT暴露7 d后，其肝脏中vtg基因mRNA的表达变化情况。结果表明，与对照组相比，25、50、100 ng/L的MT暴露7 d后，雌鱼肝脏中vtg基因的mRNA 表达均被显著抑制（P＜0.05 或 P＜0.01），尤其是50 ng/L的MT，其对雌鱼肝脏中vtg基因mRNA的表达抑制作用最为显著（P＜0.01，见图1A）；对于斑马鱼雄鱼，50 ng/L的MT暴露7 d后，雄鱼肝脏vtg基因的 mRNA表达量显著升高 （P＜0.05），100 ng/L的MT暴露7 d后，雄鱼肝脏vtg基因mRNA的表达量极显著升高（P＜0.01），而25 ng/L的MT暴露7 d后，雄鱼肝脏vtg基因的mRNA表达未受到显著影响（P＞0.05，见图 1B）。

3 讨论

该试验研究了MT处理斑马鱼成鱼7 d后雌、雄鱼肝脏vtg基因mRNA表达量的变化情况，结果表明，利用50 ng/L或100 ng/L的MT处理7 d后，可引起斑马鱼雄鱼肝脏中vtg基因mRNA的表达量显著升高（P＜0.05或 P＜0.01），提示雄激素可能参与雄鱼肝脏VTG的合成。研究表明，利用4.5 ng/L的MT暴露斑马鱼雄鱼7 d后，其肝脏VTG的含量显著升高［10］。 高浓度的 MT 暴露（0.2～200 μg/L）同样可以使黑头软口鲦雄鱼体内的VTG含量显著升高［3，11］。 有学者推测，MT 之所以可以使鱼类体内的VTG含量升高，可能是由于MT被芳香化成了甲雌二醇（ME2），随后，ME2作为雌激素通过肝脏中的雌激素受体使得vtg基因的表达升高［3］。在该研究中，利用25～100 ng/L的MT暴露7 d后，雌鱼肝脏中vtg基因mRNA的表达量显著下调 （P＜0.05或P＜0.01），该结果与大多数已经报道的相关研究结果一致。Seki等［12］将日本青鱂幼鱼从孵化开始一直暴露于 MT（0.35～9.98 ng/L）中直至孵化后 60 d，结果表明，雌鱼体内的VTG水平受到显著抑制。利用MT处理罗非鱼雌鱼后，其肝脏中vtg基因的mRNA表达水平和VTG的水平均下降［13］。斑马鱼幼鱼暴露于100、260、500 ng/L的MT后，雌鱼体内的VTG含量显著降低［14］。 Korsgaard［15］研究表明，100 ng/L的MT能够显著降低绵鳚雌鱼体内的VTG水平。但是，也有学者研究发现，利用MT（0.2 mg/L和2 mg/L）暴露黑头软口鲦雌鱼21 d，其体内VTG含量呈升高趋势［11］，推测这可能是由于种间差异造成的VTG/vtg对MT有不同的响应。综上所述，50 ng/L的MT对斑马鱼雌鱼肝脏vtg基因mRNA的表达产生最为显著的影响，可以作为检测环境中MT的生物标志物。

［1］RUTHERFORD R，LISTER A，HEWITT L M，et al.Effects of model aromatizable （17α-methyltestosterone）and nonaromatizable（5α-dihydrotestosterone） androgens on the adult mummichog （Fundulus heteroclitus） in a short-term reproductive endocrine bioassay［J］.Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2015，170：8-18.

［2］SHARPE L，MACLATCHYD，COURTENAYS，etal.Effects of a model androgen （methyltestosterone） and a model anti-androgen （cyproterone acetate）on reproductive endpoints in a short-term adult mummichog（Fundulus heteroclitus）bioassay ［J］.Aquat Toxicol，2004，67 （3）：203-215.

［3］HORNUNG M，JENSEN K，KORTE J，et al.Mechanistic basis for estrogenic effects in fathead minnow（Pimephales promelas）followingexposuretotheandrogen 17α -methyltestosterone：conversion of 17α -methyltestosterone to 17α-methylestradiol ［J］.Aquat Toxicol，2004，66（1）：15-23.

［4］LI G L，LIU X C，LIN H R.Effects of aromatizable and nonaromatizable androgens on the sex inversion of redspotted grouper （Epinephelus akaara） ［J］.Fish Physiol Biochem，2006，32（1）：25-33.

［5］MARTYNIUK C J，DENSLOW N D.Exploring androgenrelated pathways in teleost fish using transcriptomics and proteomics［J］.Integr Comp Biol，2012，52（5）：695-704.

［6］ANKLEY G T，JENSEN K M，DURHAN E J，et al.Effects of two fungicides with multiple modes of action on reproductive endocrine function in the fathead minnow（Pimephales promelas）［J］.Toxicol Sci，2005，86 （2）：300-308.

［7］HUTCHINSON T H，ANKLEY G T，SEGNER H，et al.Screening and testing for endocrine disruption in fishbiomarkers as signposts not traffic lights，in risk assessment ［J］.Environ Health Perspect， 2006，114（Suppl 1）：106-114.

［8］LIU S，WANG L，QIN F，et al.Gonadal development and transcript profiling of steroidogenic enzymes in response to 17α-methyltestosterone in the rare minnow Gobiocypris rarus［J］.J Steroid Biochem，2014，14：223-232.

［9］ZHANG W，SHENG N，WANG M，et al.Zebrafish reproductive toxicity induced by chronic perfluorononanoate exposure［J］.Aquat Toxicol，2016，175：269-276.

［10］ANDERSEN L，GOTO-KAZETO R，TRANT J M，et al.Short-term exposure to low concentrations of the synthetic androgen methyltestosterone affects vitellogenin and steroid levels in adult male zebrafish（Danio rerio）［J］.Aquat Toxicol，2006，76（3/4）：343-352.

［11］ANKLEY G T，JENSEN K M，KAHLM D，etal.Description and evaluation of a short-term reproductive test with the fathead minnow （Pimephales promelas）［J］.Environ Toxicol Chem，2001，20（6）：1276-1290.

［12］SEKI M，YOKOTA H，MATSUBARA H，et al.Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka（Oryzias latipes） ［J］.Environ Toxicol Chem，2004，23（3）：774-781.

［13］LAZIER C B，LANGLEY S，RAMSEY N B，etal.Androgen inhibition of vitellogenin gene expression in tilapia（Oreochromis niloticus）［J］.Gen Comp Endocrinol，1996，104（3）：321-329.

［14］ÖRN S，HOLBECH H，MADSEN T H，et al.Gonad development and vitellogenin production in zebrafish（Danio rerio）exposed to ethinylestradiol and methyl testosterone［J］.Aquat Toxicol，2003，65 （4）：397-411.

［15］KORSGAARD B.Effects of the model androgen methyltestosterone on vitellogenin in male and female eelpout，Zoarces viviparus（L） ［J］.Mar Environ Res，2006，62（Suppl）：S205-S210.

Effect of 17α-methyltestosterone(MT)on mRNA Expression of vtg Gene in Liver of Brachydanio rerio

LIU Shao-zhen，LÜ Wen-qi，LÜ Xiao-ye
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

This study aimed to evaluate the effect of 17α-methyltestosterone（MT） on mRNA expression of vtg gene in liver of Brachydanio rerio.The male and female Brachydanio rerio were treated with different concentrations of MT for 7 days,and qRTPCR assay were used to determine the mRNA expression of vtg gene in their livers.For female Brachydanio rerio,the mRNA expression of vtg gene in 25 ng/L MT treatment group was significantly reduced after 7 days （P＜0.05）,and that in 50 and 100 ng/L MT treatment group was extremely significantly reduced（P＜0.01）.For male Brachydanio rerio,there were no significant differences in the mRNA expression of vtg gene between 25 ng/L MT treatment group and control group after 7 days （P＞0.05）.However,the mRNA expression of vtg gene in 50 and 100 ng/L MT treatment groups was significantly and extremely significantly increased （P＜0.05 and P＜0.01）,respectively.The results suggest that the vtg gene in liver of Brachydanio rerio is sensitive to MT,and it is potential to serve as a biomarker for MT monitoring in environment.

17α-methyltestosterone；Brachydanio rerio；liver；vtg

X171.5

A文章顺序编号：1672-5190（2016）05-0009-03

2016-05-03

项目来源：山西农业大学引进人才博士科研启动费项目（2014YJ08）。

刘少贞（1983—），女，讲师，博士，主要研究方向为环境毒理学。

（责任编辑：赵俊利）