贵州优良地域种斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞周期的影响*

刘　流，郭　侃，晏　容,2，刘　云，李晓飞,2

(1.遵义医学院 寄生虫学教研室，贵州 遵义　563099；2.贵州省普通高等学校 特色药物肿瘤防治特色重点实验室，贵州 遵义　563099；3.遵义医学院 医学与生物学研究中心，贵州 遵义　563099)



基础医学研究

贵州优良地域种斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞周期的影响*

刘流1，郭侃1，晏容1,2，刘云2,3，李晓飞1,2

(1.遵义医学院 寄生虫学教研室，贵州 遵义563099；2.贵州省普通高等学校 特色药物肿瘤防治特色重点实验室，贵州 遵义563099；3.遵义医学院 医学与生物学研究中心，贵州 遵义563099)

目的 研究贵州罗甸县城区及茂井镇地区南方大斑蝥(MylabrisphalerataPallas)和黄黑小斑蝥(MylabriscichoriiLinnaeus)体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞周期的影响。方法 斑蝥三氯甲烷提取物的水浸液获取结合斑蝥素; 应用倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化; 采用PI标记结合流式细胞术检测细胞周期的变化。结果 罗甸县城区及茂井镇斑蝥的结合斑蝥素均能使细胞数量明显减少, 出现固缩、体积变小等现象; 茂井镇南方大斑蝥和黄黑小斑蝥可使S期细胞比率下降, G2/M期细胞比率明显增加, 出现G2/M期阻滞; 罗甸城区南方大斑蝥和黄黑小斑蝥可使G0/G1期细胞比率明显增加, S期细胞比率下降。结论 贵州罗甸县城区南方大斑蝥、黄黑小斑蝥及茂井镇地区南方大斑蝥、黄黑小斑蝥4种来源斑蝥体内结合斑蝥素可能是通过阻滞人肝癌HepG2细胞周期而抑制其生长。

结合斑蝥素; 南方大斑蝥; 黄黑小斑蝥; 肝癌HepG2细胞; 细胞周期

药用昆虫作为我国传统药物的天然来源, 以其药性温和、毒性作用小的特点, 受到临床的广泛关注。中药斑蝥属昆虫纲鞘翅目芫菁科昆虫, 是南方大斑蝥(大斑芫菁MylabrisphalerataPallas)或黄黑小斑蝥(眼斑芫菁,MylabriscichoriiLinnaeus)的干燥虫体[1]。其体内斑蝥素(cantharidin, CA)已被证实对肝癌、膀胱癌、结直肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤具有抑制作用[2-6], 课题组前期研究发现斑蝥素是以游离斑蝥素和结合斑蝥素两种形式存在, 其中结合斑蝥素的体外抗肿瘤活性高于游离斑蝥素[7], 并且存在地域差异性。例如贵州罗甸县城区及茂井镇境内的南方大斑蝥和黄黑小斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用明显优于其它地区同种斑蝥[8], 但其机制不清。

研究表明, 细胞周期在肿瘤细胞的生长调控中具有重要作用, 通过改变细胞周期来阻止肿瘤细胞无限增殖已受到人们关注。如王浴生[9]研究发现, 斑蝥素通过影响细胞周期的进程, 促进肿瘤细胞凋亡, 从而抑制肿瘤细胞增殖。在此基础上, 本文拟对贵州优良地域种斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞周期的影响进行探讨, 初步明确其体外抗癌效应, 为这一优良地域种的开发利用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料斑蝥虫体收集自贵州省罗甸城区及茂井镇产区, 经遵义医学院李晓飞博士鉴定虫体为南方大斑蝥或黄黑小斑蝥。人肝癌细胞HepG2细胞由遵义医学院医学与生物学研究中心提供。RPMI-1640培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)、PI试剂盒(美国eBioscience公司), 其余试剂均为国产分析纯。

1.2仪器超净工作台(苏州净化公司, 型号JJ-CJ-IFD); 3131型CO2培养箱(THERMO FORMA 3131); 超纯水制备系统(美国Millpore公司, 型号MillI-Q);FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司, 型号TY 1218)。

1.3实验方法

1.3.1结合斑蝥素提取纯化[10]南方大斑蝥和黄黑小斑蝥虫体烘干后用粉碎机粉碎, 干燥后置于容器中, 加足量三氯甲烷, 摇匀, 静止24 h, 过滤, 残渣用三氯甲烷冲洗3次, 干燥, 获得去除游离斑蝥素的斑蝥粉末, 取重量为20倍的蒸馏水浸泡24 h, 过滤, 分别得南方大斑蝥结合斑蝥素(以下简称为BCMP)和黄黑小斑蝥结合斑蝥素(以下简称为BCML), 抽滤除菌, 备用。

1.3.2细胞培养人肝癌细胞HepG2采用RPMI-1640培养基(含10%的胎牛血清), 37 ℃、5% CO2培养。待细胞长至对数生长期, 弃培养液, PBS冲洗, 0.25%胰蛋白酶消化, 加培养液吹打均匀成单细胞悬液, 取100 μL细胞悬液(含8 000～10 000个细胞)接种96孔培养板, 于CO2培养箱中培养。将所选优良地域种群的BCMP和BCML稀释后分别作用于HepG2肝癌细胞, 并设空白对照组, 于培养箱中培养48 h后,置于倒置显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化。

1.3.3PI标记结合流式细胞术检测HepG2细胞周期消化HepG2细胞, 将细胞接种于6孔板2块, 加入培养基于CO2培养箱中培养20 h, 弃培养液, PBS洗涤2次, 分别加入含BCMP和BCML的培养基2 mL, 使药液终浓度分别为各自对HepG2细胞的半数抑制浓度(IC50)[11], 同时设空白对照组(加与实验组等量的培养基), 每组设3个复孔, 继续培养24 h, PBS洗涤1次, 10%缓冲液洗涤1次, 调整细胞浓度为1×106～5×106/ mL, 取100 μL细胞悬液放入含有100 μL10%缓冲液的EP管中, 加5 μL PI于细胞悬液中,2～8 ℃避光、混匀, 进流式检测。

2　结果

2.1茂井镇和罗甸城区两种斑蝥结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞形态的影响与对照组比较茂井镇和罗甸城区BCMP、BCML对HepG2细胞形态的影响(见图1), 细胞数目明显减少, 形态不规则, 并出现固缩、体积变小现象, 细胞贴壁差。

2.2茂井镇和罗甸城区两种斑蝥结合斑蝥素对HepG2细胞周期的影响茂井和罗甸的BCMP和BCML以各自的IC50处理HepG2细胞24 h后细胞周期的变化结果(见表1), 与空白对照组比较, 两产区两种斑蝥体内结合斑蝥素均可对HepG2细胞的周期产生影响, 茂井BCMP和BCML可使S期细胞数百分比下降, G2/M期细胞数百分比明显增加, 出现G2/M期阻滞; 罗甸BCMP和BCML可使G0/G1期细胞百分比明显增加, S期细胞百分比下降,出现G0/G1期阻滞。

表1茂井和罗甸两种斑蝥结合斑蝥素作用HepG2细胞24 h周期变化的统计分析(%)

组别G0/G1SG2/M空白对照组57.26±2.9735.19±3.187.54±0.60茂井BCMP67.05±3.4412.32±1.94*20.63±1.97*茂井BCML63.61±4.079.89±1.84*26.50±2.70*罗甸BCMP73.20±3.54*15.53±2.16*11.27±1.45罗甸BCML74.04±3.75*15.28±2.34*10.68±1.51

与空白对照组比较, *P<0.05。BCMP:南方大斑蝥结合斑蝥素; BCML: 黄黑小斑蝥结合斑蝥素。

A: 空白对照组; B: 茂井BCMP组; C: 茂井BCML组; D: 罗甸BCMP组; E: 罗甸BCML组。　　图1　茂井镇和罗甸城区两种斑蝥结合斑蝥素作用HepG2细胞48 h的形态变化

3　讨论

细胞周而复始经历G1→S→G2→M的变化阶段, 这种生长、分裂循环即称为细胞周期。由于细胞周期在肿瘤细胞的增殖调控中起着重要作用, 因此有许多抗肿瘤药物是通过阻滞肿瘤细胞周期以抑制细胞增殖和促进细胞凋亡而发挥抗癌作用的[12]。例如抗癌药物斑蝥素通过影响细胞周期来发挥抑癌作用。

本研究通过水提法提取纯化出罗甸城区及茂井镇产区南方大斑蝥和黄黑小斑蝥体内结合斑蝥素, 前期实验已证实其对人肝癌HepG2细胞有明显抑制作用, 本文在此基础上考察体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞周期的影响。结果表明, 茂井BCMP和BCML使细胞G2/M期细胞数百分比明显增加, 出现了G2/M期阻滞; 罗甸BCMP和BCML致G0/G1期细胞百分比明显增加,出现G0/G1期阻滞。提示这些地域种斑蝥体内结合斑蝥素都能干预人肝癌HepG2细胞的周期变化, 减慢细胞的增殖速率, 这可能是其抑制肿瘤细胞生长的原因之一。后续分子机制的实验正在进行之中, 我们将陆续报道。

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[9] 王浴生. 中药药理与应用[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1983: 1113.

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[收稿2016-06-27;修回2016-07-25]

(编辑：王静)

The effect on cell cycle of human hepatoma HepG2 cells by bound cantharidin from excellentMylabrislocal breed in Guizhou Province

LiuLiu1，GuoKan1，YanRong1,2，LiuYun2,3，LiXiaofei1,2

(1.Department of Parasitology,Basic Medicine School, Zunyi Medical University;2.Guizhou Provincial College-based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines; 3.Medical and Biological Research Center, Zunyi Medical University, Zunyi 563003, China)

Objective To investigate the influence on cell cycle of human hepatoma HepG2 cells by bound cantharidin collected fromMylabrisphalerataPallas,Mylabriscichorii, respectively, in Luodian District, Guizhou Province.Methods Bound cantharidin was extracted fromMylabriswater soluble matter by trichloromethane. The cell cycle change was detected by flow cytometry (FCM) with PI markers.Results The ratio of S-phase cells showed a significantly decrease, while the ratio of G2/M phase cells showed an increase, which appeared G2/M phase arrest, after the 24 hrs treatment of BCMP and BCML in Maojing Town respectively. By contrastedly, the ratio of G2/M phase cells showed a significantly increase and a narrow increase of G0/G1phase cells, which appeared G0/G1phase arrest and decrease ratio of S-phase cells, in the treatment of BCMP and BCML in Luodian Town respectively.Conclusion The effects on growth of HepG2 cells by bound cantharidin extracted from cantharis mainly attributed to the retardant of the cell cycle.

conjugated cantharidin;MylabrisphalerataPallas;MylabriscichoriiLinnaeus;human hepatoma HepG2 cells; cell cycle

国家自然科学基金资助项目(NO：81260488)；贵州省科技厅中药现代化项目(NO：黔科合ZY字[2013]3012)；贵州省科技厅社会发展攻关项目(NO：黔科合SY字[2012]3082)；贵州省教育厅特色重点实验室建设项目(NO：黔科合KY字[2014]212)。

李晓飞，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：药用昆虫及昆虫毒素，E-mail:lixiaofei35@mail.com。

R931

A

1000-2715(2016)04-0372-03