太子参中芜菁花叶病毒的RT-PCR检测

黄颖桢，陈菁瑛，朱景花，刘保财，赵云青

(福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建　福州　350003)



太子参中芜菁花叶病毒的RT-PCR检测

黄颖桢，陈菁瑛*，朱景花，刘保财，赵云青

(福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建福州350003)

建立并应用太子参中芜菁花叶病毒的检测技术。采用RT-PCR技术，设计特定引物从太子参病株中的不同部位扩增特定片段，且进行序列分析和比对。序列比对结果表明，扩增得到的片段为芜菁花叶病毒外壳蛋白基因序列片段，本研究建立了一种简便可靠太子参中芜菁花叶病毒的检测方法，并且从太子参根、茎、叶和花中均检测到病毒目标序列。

太子参；TuMV；RT-PCR

太子参Pseudostellaria heterophylla(Miq.)PaxetHoffm为石竹科异叶假繁缕属植物，又名孩儿参、童参等，是常用中药材之一，以干燥块根提供药用[1]。福建省柘荣县被誉为全国太子参之乡，全县90%以上农民种植太子参[2]。长期以来，太子参均以块根进行无性繁殖，体内浸染并积累多种病毒，严重影响了太子参的产量和质量。

太子参病毒病又称花叶病，是太子参产区发生普遍、危害严重的病害之一，严重影响产量和品质[3]。染病叶常表现为花叶、斑驳花叶、皱缩、扭曲、畸形、叶缘卷曲、叶质脆硬，病株矮小、块根小且根数明显减少，严重者整株死亡[4]。目前已知危害太子参的病原有4种[5]，分别为烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)，芜菁花叶病毒(Turnipmosaicvirus，TuMV)，黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)和蚕豆萎蔫病毒(Broadbeanwilivirus，BBMV)，其中以芜菁花叶病毒广泛分布于全国太子参各产区[6]，是为害太子参的主要病毒病原。

近年来，太子参的相关研究集中在栽培技术和药材质量方面，而对太子参中各种病毒的检测研究较少。本研究针对高度保守的芜菁花叶病毒CP基因，采用RT-PCR技术，对太子参病株的各个部位进行了芜菁花叶病毒检测，以期为太子参的病毒防治和脱毒种苗制备提供科学依据。

1　材料和方法

1.1材料与试剂

材料及采集保存：太子参病株样品来源于福建省宁德市柘荣县。采集新鲜植物组织，迅速移入液氮保存，用于总RNA提取。

1.2试验方法

1.2.1引物设计根据GenBank中已登录的TuMVCP基因的核苷酸序列(登录号为AJ000690.1)设计TuMV引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。上游引物F：5′-ACCAAGACCGACCATACA-3′；下游引物R：5′-CCATAAGCGAGAATACTAACG-3′。

1.2.3RT-PCR检测病毒PCR反应体系50 mm3：10×PCR Buffer(含Mg2+)5 mm3，dNTP(2.5 mmol·dm-3)4 mm3，正、反向引物(10 μmol·dm-3)各2 mm3，TaqDNA Polymerase(5 U·mm-3)0.5 mm3，cDNA模板量约2 mm3，补足双蒸水至总体积为50 mm3。PCR反应程序：94℃ 预变性5 min；94℃ 变性30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s，共40个循环；72℃ 延伸10 min；4℃ 停止。扩增得到的PCR产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳分析，目的条带送测序，测序结果进行比对分析。

1.2.4序列及分析PCR产物直接测序，方法简便可靠。将扩增得到的PCR产物直接送铂尚生物技术(上海)有限公司测序，测序结果在NCBI上进行Blast比对分析。

2　结果与分析

2.1总RNA提取

紫外分光光度计检测所提取的太子参病叶总RNAOD260/OD280比值在1.8 ～ 2.0范围内。琼脂糖凝胶电泳表明，所提取的RNA主带清晰，没有明显降解，符合试验要求(图1)。

2.2TuMV CP基因RT-PCR及序列分析

太子参cDNA中扩增得到目的CP基因序列电泳图(图2)。对扩增得到的目的片段进行测序分析(图3)，经过NCBI Blast分析，扩增得到的序列与烟草花叶病毒的CP基因片段相似度高(图4)，结果表明目的片段为芜菁花叶病毒的CP基因片段。

2.3病株不同部位病毒检测

按照本试验建立的RT-PCR方法对太子参病株的不同组织分布进行检测，选取带花的太子参植株进行检测，选取部位包括叶肉、叶脉、花、茎上部、茎中部、茎下部、根上部、根中部、根下部和须根。通过RT-PCR技术检测，结果(图5)显示感染芜菁花叶病毒的太子参在各部位均有分布。

3　讨　论

本试验建立太子参中芜菁花叶病毒的RT-PCR检测方法，同时应用该方法对太子参病株不同部位的芜菁花叶病毒进行检测分析。

相对于传统的病毒分离电镜检查、ELISA、核酸杂交和基因芯片等其他病毒检测方法，RT-PCR方法具有灵敏度高、操作简便、特异性较高和成本较低等优点[7-8]，能够满足了大规模病毒样品的分析。

福建省柘荣县太子参病毒种类多样，除芜菁花叶病毒，本课题组还在不同的样品中检测到蚕豆萎蔫病毒、烟草花叶病毒。多种病毒的作用造成了太子参病毒病危害严重，造成太子参减产和农民减收，所以本文建立的太子参的病毒检测技术，进而进行多种病毒的多重检测技术研发，为太子参病毒防治，开发太子参脱毒种苗，提高太子参的产量和质量提供技术保障。

[1]肖培根,李大鹏,杨世林. 新编中药志：第一卷[M]. 北京:化学工业出版社，2002：191-193.

[2]袁小坦，袁家雄. 柘荣县太子参产业发展现状与对策[J]. 福建农业科技，2014,(7)：:68-70.

[3]吴朝峰, 林彦铨. 药用植物太子参的研究进展[J]. 福建农林大学学报: 自然科学版, 2005, 33(4): 426-430.

[4]刘清琪, 等.太子参花叶病病原及其防治的初步研究[J].中药材科技, 1953， (2): 11.

[5]宋荣浩，濮祖芹. 太子参病毒病病原鉴定[J].上海农业学报，1991，7(2):80-85.

[6]朱艳, 周小华, 秦民坚. 太子参病毒病及其脱病毒研究进展[J]. 中国野生植物资源, 2005, 24(2): 31-32.

[7]王新, 莫笑晗, 林良斌. 分子生物学技术在植物病毒检测中的应用[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(28):13498-13500.

[8]周利飞，刘映红，孙现超，等。 烟草芜菁花叶病毒的ELISA和RT-PCR快速检测技术研究[J]. 西南农业学报，2007,20(4)：758-761.

(责任编辑：柯文辉)

RT-PCR Detection of Turnip Mosaic Virus onPseudostellariaheterophylla

HUANG Ying-zhen, CHEN Jing-ying*， ZHU Jing-hua, LIU Bao-cai, ZHAO Yun-qing

(InstituteofAgriculturalBio-resourcesFujianAcademyofAgriculturalScience，Fuzhou，Fujian350003，China)

Amethodtodetecttheturnipmosaicvirus(TuMV)ondiseasedPseudostellaria heterophyllawasestablishedandapplied.SpecificgeneticfragmentsatdifferentlocationsinTuMVwasamplifiedbyRT-PCR,sequenced,andaligned.Thesequencealignmentindicatedthatthefragmentwasthecoatprotein(CP)geneofTuMV.Hence,asimple,reliabledetectionmethodbasedontheCPgenesequenceofTuMVforthediagnosisondiseasedP. heterophyllawasestablished.Usingthemethod,thetargetsequencewasdetectedintheroot,stem,leaf,andflowerofP. heterophylla.

Pseudostellaria heterophylla;turnipmosaicvirus;RT-PCR

黄颖桢，陈菁瑛，朱景花，等.太子参中芜菁花叶病毒的RT-PCR检测[J].福建农业学报，2016，31(6)：616-619.

HUANG Y-Z，CHEN J-Y，ZHU J-H，et al.RT-PCR Detection of Turnip Mosaic Virus onPseudostellariaheterophylla[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(6)：616-619.

2016-03-02初稿；2016-04-15修改稿

黄颖桢(1976-)，男，助理研究员，主要从事药用植物分子生物学研究 (E-mail：hyzmprc@163.com)

陈菁瑛(1966-)，女，研究员，主要从事植物生物技术和药用植物资源利用研究(E-mail：cyj6601@163.com)

福建省种业创新与产业化工程项目(2014S1477-12);福建省自然科学基金项目(2015J01292)

S436.3

A

1008-0384(2016)06-616-05