肾炎康血清干预嘌呤霉素氨基核苷诱导足细胞损伤研究

向少伟，辛立红，黄国东，贺西南，黄海燕，龙　韵

（1.广西中医药大学附属瑞康医院肾内科，广西 南宁 530011；2.广西中医药大学，广西 南宁 530001）

论 著

肾炎康血清干预嘌呤霉素氨基核苷诱导足细胞损伤研究

向少伟1，辛立红2，黄国东1，贺西南1，黄海燕1，龙韵1

（1.广西中医药大学附属瑞康医院肾内科，广西 南宁 530011；2.广西中医药大学，广西 南宁 530001）

目的：探讨复方肾炎康对嘌呤霉素氨基核苷诱导足细胞损伤的保护作用。方法：原代培养大鼠足细胞，随机分为正常组，对照组，肾炎康低、中、高剂量组，厄贝沙坦组除正常组外，其余各组分别予以嘌呤霉素氨基核苷，正常组加正常大鼠血清，肾炎康低、中、高剂量组分别加肾炎康低、中、高剂量，厄贝沙坦组加厄贝沙坦，均干预48h。用原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡，实时定量PCR方法检测P53、Caspase 3 mRNA，western印迹检测细胞中P53、Caspase 3蛋白变化。结果：嘌呤霉素氨基核苷作用下的各组足细胞凋亡率、P53、Caspase 3mRNA及蛋白表达均显著高于正常组（P＜0.05，P＜0.01），药物干预的各组足细胞凋亡率、P53、Caspase 3 mRNA及蛋白表达均显著低于对照组（P＜0.05，P＜0.01），肾炎康高剂量组足细胞凋亡率、P53、Caspase 3 mRNA及蛋白表达与厄贝沙坦组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：中药复方肾炎康能抑制嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞凋亡，其机制可能与抑制P53、Caspase 3表达有关。

足细胞；凋亡；肾炎康；嘌呤霉素氨基核苷

足细胞是高度分化的细胞，是肾脏滤过屏障的关键元素，足细胞的损失在肾小球硬化和进行性蛋白尿肾脏疾病的发病机制中起着重要作用［1］。嘌呤霉素氨基核苷能诱导肾病综合征模型［2］，对足细胞具有显著致凋亡作用［3］。我们利用嘌呤氨基核苷诱导足细胞凋亡的体外损伤模型，观察肾炎康血清对足细胞损伤的保护作用及其机制，总结如下。

1　材料与方法

1.1实验动物

6周龄SPF/VAF级雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，由广西中医药大学实验动物中心提供（合格证号SCXK桂 2003-0003）。

1.2主要试剂

TRIzol Reagent（美国Invitrogen），RNA的逆转录试剂盒逆转录、SYBR Green mix（日本TOYOBO），TUNEL检测试剂盒（美国Promega），DMEM培养基（美国Gibco），兔抗大鼠P53抗体、Caspase 3抗体、大鼠多克隆β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（美国Sigma），ECL试剂盒（美国Santa Cruz）。

1.3实验方法

大鼠足细胞原代培养与鉴定［4］。无菌取肾后，通过差异过筛法迅速分离肾皮质，收集200目筛网上肾小球进行接种，37℃、5% CO2恒温恒湿培养7、8天后消化，消化后产物通过200目筛网过滤，收集细胞传代培养7d，采用倒置相差显微镜观察足细胞形态及免疫荧光染色进行鉴定，流式细胞仪分析细胞纯度。

含药血清的制备。中药复方肾炎康由八仙草、田七、薏苡仁、鹿含草按3∶1∶2∶2比例组成。以蒸馏水煎煮3次，过滤、浓缩至含生药2.5g/mL，高压灭菌，置于4℃冰箱保存待用。将48只SD大鼠随机分为正常组、对照组、肾炎康低、中、高剂量组和厄贝沙坦组，每组8只。正常组予以蒸馏水3mL灌胃，每日2次；其余各组分别予以氨基核苷嘌呤霉素5mg/100g（溶于蒸馏水3mL）、肾炎康成人临床用药剂量5倍（13.5g/kg）、10倍（27g/kg）、20倍（54g/kg）及厄贝沙坦片成人临床用药剂量10倍（25mg/kg），灌胃（均蒸馏水稀释至3mL），每日2次，连续7天。末次灌胃2h后股动脉取血，离心取血清，56℃水浴30min灭活补体，无菌针孔滤器（0.22μm）过滤除菌，分别制成正常大鼠血清、氨基核苷嘌呤霉素血清、肾炎康低、中、高剂量血清和厄贝沙坦血清，分装置入-20℃冻存。

足细胞的分组及处理。等量足细胞接种和生长，细胞用PBS洗涤2次，在含1%FCS培养24h。实验分为6组：①正常组：正常大鼠血清；②对照组：氨基核苷嘌呤霉素血清加正常大鼠血清；③肾炎康低剂量组：氨基核苷嘌呤霉素血清加肾炎康低剂量血清；④肾炎康中剂量组：氨基核苷嘌呤霉素血清加肾炎康中剂量血清；⑤肾炎康高剂量组：氨基核苷嘌呤霉素血清、肾炎康高剂量血清；⑥厄贝沙坦组：氨基核苷嘌呤霉素血清加厄贝沙坦血清。每组设平行孔8孔，培养干预48h。

原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡：用TUNEL检测试剂盒检测进入凋亡晚期的足细胞。操作步骤按说明书进行，荧光显微镜下细胞核绿色的为凋亡细胞。每张切片随机选取5个视野（×400），计算凋亡指数（Apoptosis index，AI）：AI=凋亡细胞数/总细胞数。

实时定量PCR方法检测P53、Caspase 3 mRNA水平。Trizol法提取细胞总RNA，在逆转录酶作用下合成cDNA后进行RT-PCR反应。采用Primer Premier 5.0软件设计引物序列，见表1。反应条件为94℃2min预变性，94℃30s、56℃30s、72℃30s，35个循环，最后72℃7min延伸。绘制动力学曲线，读取Ct值，以GAPDH为内参照，用2-△△Ct法计算目的基因表达量。目的基因量=2-△△Ct，△△Ct=实验组（Ct目的基因-Ct内参基因）-正常组（Ct目的基因-Ct内参基因）。见表1。

表1　P53、Caspase 3、GAPDH引物序列Table1 Primer sequence of P53，Caspase 3 and GAPDH

western印迹检测P53、Caspase 3蛋白表达。收集细胞，加入RIPA裂解缓冲液，置冰上30min，离心后取上清，Bradford法测定蛋白浓度。每样品取30μg总蛋白，以10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至尼龙膜，经脱脂奶粉封闭1h，加入一抗，4℃孵育过夜，洗去一抗后，再加入相应辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h。洗膜，ECL化学发光法胶片曝光并成像。用图像分析软件（UVI tec，英国）对X线片上杂交条带进行半定量分析，目的蛋白条带与β-actin条带的积分吸光度比值为最终结果。

2　结果

各组细胞凋亡率比较见表2。与正常组比较，嘌呤氨基核苷作用下各组足细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；与对照组比较，药物干预后的各组足细胞凋亡率显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与厄贝沙坦组比较，肾炎康中、高剂量组足细胞凋亡率无统计学意义（P＞0.05）。

表2　各组足细胞凋亡率比较 （%，）

表2　各组足细胞凋亡率比较 （%，）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与厄贝沙坦组比较，##P＜0.01。

组别n凋亡率正常组84.28±1.33对照组817.36±3.45**肾炎康低剂量组814.02±2.64**△##肾炎康中剂量组812.03±2.32**△△肾炎康高剂量组88.86±2.32**△△厄贝沙坦组89.32±2.87**△△

各组足细胞P53 mRNA及蛋白的表达比较见表3。与正常组比较，嘌呤氨基核苷作用下的各组足细胞P53 mRNA及蛋白的表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；与对照组比较，药物干预后的各组足细胞P53 mRNA及蛋白的表达显著下降（P＜0.05，P＜0.01）；与厄贝沙坦组比较，肾炎康高剂量组足细胞P53 mRNA及蛋白的表达无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3　各组足细胞P53 mRNA及蛋白表达比较 （）

表3　各组足细胞P53 mRNA及蛋白表达比较 （）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与厄贝沙坦组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别nP53/ GAPDHP53/β-actin正常组81.000±0.0000.121±0.022对照组81.766±0.274**1.117±0.075**肾炎康低剂量组81.475±0.251**△##0.902±0.057**△△##肾炎康中剂量组81.401±0.227**△#0.741±0.062**△△##肾炎康高剂量组81.162±0.201*△△0.483±0.053**△△厄贝沙坦组81.143±0.182*△△0.506±0.057**△△

各组足细胞Caspase 3 mRNA及蛋白的表达比较见表4。与正常组比较，嘌呤氨基核苷作用下的各组足细胞Caspase 3 mRNA及蛋白的表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；与对照组比较，药物干预后的各组足细胞Caspase 3 mRNA及蛋白的表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与厄贝沙坦组比较，肾炎康高剂量组足细胞Caspase 3 mRNA及蛋白的表达无统计学意义（P＞0.05）。

表4　各组足细胞Caspase 3mRNA及蛋白表达比较（）

表4　各组足细胞Caspase 3mRNA及蛋白表达比较（）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与厄贝沙坦组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

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3　讨论

研究表明足细胞减少20%以下就出现系膜扩张、一过性蛋白尿；减少21%～40%，出现球囊粘连和局灶节段肾小球硬化，轻度持续性蛋白尿，肾功能正常；减少大于40%，出现节段性到全球性肾小球硬化，持续性大量蛋白尿，肾功能减退［5］。越来越多的证据表明，足细胞凋亡是足细胞数量下降的主要原因，并导致蛋白尿和肾小球损伤。人类p53基因是一种功能强大的抑癌基因，对细胞周期和细胞凋亡起着关键性调控作用，p53可以通过上调Bax的表达水平和下调Bcl-2的表达而促进细胞凋亡作用。高糖、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、转化生长因子-β1（TGF-β1）等诱导的足细胞凋亡均与P53活化有关［6-8］。半胱天科氨酸蛋白酶家族（Caspase）是一类与凋亡密切相关的蛋白水解酶家族，负责选择性地切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡。其中Caspase 3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，在细胞凋亡中起着不可替代的作用。研究表明，AngⅡ使体外培养小鼠足细胞Caspase-3活性增加，从而诱导足细胞凋亡［9］。而AT1受体阻断剂能抑制糖尿病肾病模型大鼠肾脏TGF-β1表达，进而使细胞凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3的表达减少，从而减少足细胞凋亡［10］。我们的研究表明，嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞凋亡，也与p53及Caspase-3活化有关，这与既往的研究一致［11-12］。

慢性肾脏病主要表现为水肿、蛋白尿、血尿等，反复发作，缠绵难愈，属中医“水肿”、“虚劳”等范畴。中医认为本病除脾肾亏虚之外，湿热病邪是关键。或因湿邪久恋，郁而化热；或因素体阴虚内热，热与湿合；或感染热毒，与湿相合；或因药邪（激素、抗生素等）所伤，助湿化热。故有“肾炎湿热论”之说［13］。而湿热之邪易与瘀合，如湿邪久蕴，阻滞气机、闭滞脉络而成瘀；或湿热煎液成瘀；或久病气虚，血行不畅而成瘀。肾炎康汤主要含八仙草、三七、薏苡仁、鹿含草等。方中八仙草清湿热、散瘀、消肿、解毒、利尿；三七有散瘀止血、消肿止痛、补血活血等功效；薏苡仁健脾利水渗湿；佐以鹿含草补虚益肾。全方以清热利湿，活血化瘀为主，祛邪而不伤正，扶正而不留邪。本研究结果显示，肾炎康含药血清能显著降低嘌呤氨基核苷诱导的大鼠足细胞凋亡率，抑制P53及Caspase 3合成，其高剂量组效果与厄贝沙坦相当。据此我们推测，中药复方肾炎康可能通过抑制P53及Caspase 3的表达，减少足细胞的凋亡，从而起到减轻肾损害的作用。

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Objective：To investigate the protective effect of Compound ShenYanKang Granules，a Chinese herbal recipe mainly composed of Galium aparine，Panax notoginseng，Coicis Semen，Herba Pyrolae，on the podocyte injury induced by Puromycin amino nucleside. Method：The primary-cultured podocytes of rats were randomly divided into normal group，control group，low-dose，middle-dose， high-dose groups of ShenYanKang and irbesartan group. The podocytes in the normal group were given normal rat serum alone while that of the other groups were all given serum containing Puromycin amino nucleoside，and additionally，ShenYanKang groups and irbesartan group were given serum containing low-dose，middle-dose and highdose ShenYanKang and irbesartan respectively for 48 hours. The apoptosis of podocyte was determined by TUNEL assay. P53 and Caspase-3 mRNA were observed by real-time PCR. Expression of p53 and Caspase-3 protein were examined by Western blot. Result：The apoptosis rate of podocytes，P53 and Caspase 3 mRNA expression level in Puromycin amino nucleoside control group were significantly higher than that in the normal group（P＜0.05 or P＜0.01），and were decreased in the medication groups（P＜0.05 or P＜0.01 compared with that in Puromycin amino nucleoside control group）.The apoptosis rate of podocytes，P53 and Caspase 3 expression level in high-dose ShenYanKang group was not significantly different from that in irbesartan group（P＞0.05）.Conclusion： Compound ShenYanKang could inhibit the podocyte apoptosis induced by Puromycin amino nucleoside and its mechanism may be related to the inhibition of P53 and Caspase 3 expression.

Podocyte；Apoptosis；ShenYanKang；Puromycin amino nucleoside

R255.689.7

B

1004-2814（2016）02-0102-03

2015-10-13

广西壮族自治区教育厅项目（编号：200810LX078）