猕猴桃AFLP分析体系的建立及其组培变异苗的动态检测

吕天雯，栗望薇，张太奎，刘惠民，李　琨

(1.西南林业大学 生命科学学院，云南 昆明 650224； 2.昆明理工大学 信息工程与自动化学院，云南 昆明 650504)



猕猴桃AFLP分析体系的建立及其组培变异苗的动态检测

吕天雯1，栗望薇1，张太奎1，刘惠民1，李琨2，*

(1.西南林业大学 生命科学学院，云南 昆明 650224； 2.昆明理工大学 信息工程与自动化学院，云南 昆明 650504)

为减少猕猴桃组培过程中变异苗带来的损失，对‘Hort 16A’猕猴桃组培继代苗进行AFLP动态监测。通过试验建立了猕猴桃基因组DNA多态性的AFLP分析体系，并对R7-R11五代75个样本进行遗传多样性分析。研究结果表明：AFLP分析体系DNA最适用量为300 ng，内切酶最适用量为1 U，酶切最适时间为4 h，T4-DNA ligase最适用量为1 U，adpter最适用量为1.5 μL，ATP最适用量为2 μL，预扩增引物(100 μmol·L-1)最适用量为0.8 μL，选择性扩增Taq酶最适用量为0.25 μL (5 000 U·mL-1)，筛选出条带数最多的引物有8对。在遗传多样性分性中，共得到494个条带，其中多态性条带为310条，多态性比例为62.7%。猕猴桃组培苗继代到第9代还能较好地保持基因遗传稳定性，从第10代开始，变异率随着继代次数的增加呈明显上升趋势。

猕猴桃；AFLP分析体系；组培变异；继代苗；动态检测

中华猕猴桃(ActinidiachinenesisPlanch)在分类上是属于猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)的多年生藤本植物，是一种原产于中国的重要果树资源[1-2]。由于猕猴桃具有较高的营养价值、药用价值和经济价值，所以对它的研究备受关注。其栽种方式有扦插、嫁接、播种和组培[3-6]，目前多以组培的方法来扩繁优良品种。在组培中，由于离体条件本身、植物生长调节物质、培养基渗透压、培养温度及培养时间、培养基的组成、激素的组成、含量和外植体再生方式等原因诱使组培苗发生变异。组培苗的变异一直都是植物组培过程中的难点，变异会影响植株的优良性状，产生不利的影响。吴伟怀等[7]在对香蕉进行组织培养时发现香蕉组培苗发生了变异；杜国强等[8]也发现苹果茎尖组培苗在继代过程中会发生变异；刘昀等[9]在香花槐组培苗快繁体系研究中发现培养基不同会影响组培苗的变异；马丹等[10]发现继代次数对组培苗的变异会产生影响，变异产生概率可随继代次数的增加而增大，变异苗数量将成几何级数增长。有些遗传变异(如隐匿变异体)在组培过程中不易发现，到大田后期才能发现，经济损失巨大。因此，在组培过程中对组培苗的变异情况进行监测显得尤为重要。

常规的变异性状鉴定方法，如形态观察、细胞遗传学分析等有其局限性，如果利用分子标记如RAPD对这些性状进行选择和监测，不仅能够在早期选择，而且不需创造逆境条件，可以节省大量的人力、物力和时间，提高育种效率[11]。常用的监测方法有RFLP，SSR，ISSR，SNP，PAPD和AFLP等，其中AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)的分子标记技术具有检测位点多、多态水平高、分子识别率好、结果稳定可靠等特点[12-17]。为此，我们采用AFLP技术动态监测猕猴桃组培苗的变异情况，通过对猕猴桃基因组DNA多态性分析、AFLP体系的优化、酶切体系和连接体系的确定、预扩增体系和选择性扩增体系的反复试验、引物的筛选，对继代苗进行多态性统计分析，监测猕猴桃组培继代苗的变异率。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

以‘Hort 16A’猕猴桃组培继代苗R7，R8，R9，R10和R11(最早的样本为R0，继代1次为R1)为材料。从继代苗中每代随机选出15株小苗，每株小苗采摘1～2片新鲜叶片，分别装于自封袋中，做好标记后放于-80 ℃保存。所用试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2试验方法

基因组DNA的提取：采用CTAB法从猕猴桃叶片提取基因组DNA。

酶切：进行一个L16(45)正交试验。将配好的体系放入PCR仪中，37 ℃ 4 h，65 ℃水浴20 min。结束后取2 μL进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，检测电压5 V·cm-1，电泳20 min。

连接：进行一个L9(34)正交试验。将配好的体系(20 μL)放入PCR仪中，25 ℃ 2 h，65 ℃ 30 min，4 ℃ 1 h。PCR完成后取2 μL进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，电压5 V·cm-1，电泳20 min。

预扩增时对引物用量进行筛选。根据单因素随机区组对引物(100 μmol·L-1)用量设计了0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μL 5个梯度进行试验。配好体系(25 μL)后将PCR管放入PCR仪中，进行预扩增。PCR结束后取2 μL进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，电压5 V·cm-1，电泳20 min。

选择性扩增要对Taq酶用量和引物的配对进行筛选。根据单因素随机区组对Taq酶(5 000 U·mL-1)用量设计了0.125，0.150，0.200，0.250 μL等4个浓度梯度进行试验。采用64对引物的排列组合进行引物的配对筛选。配好体系(25 μL)后将PCR管放入PCR仪中进行选择性扩增，在选择性扩增PCR时，退火温度每循环递减0.7 ℃。PCR结束后取2 μL进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测电压5 V·cm-1，电泳20 min。

参照张太奎[18]的方法进行PAGE变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。选择性扩增产物在6%的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。30 min预电泳后，600 V恒压，25 mA电泳4.5 h。银染显色，胶板干燥后拍照。

2　结果与分析

2.1基因组DNA的提取

由图1可看出：用CTAB法和CTAB区室法都成功提取出了猕猴桃DNA。DNA的浓度越高、杂质越少则说明其纯度越高。条带1—8与条带9—15相比亮度更亮，且杂质含量比较少，表明用CTAB区室法提取的DNA纯度较CTAB法高。

2.2酶切

由图2-A可知：第4，5，6，10，11和15号条带呈现弥散的片段，且弥散片断在500 bp左右，说明酶切效果较好。第1，2和14号条带弥散效果不明显，说明酶切效果不理想。由图2-B可知：随着DNA用量的增加，酶切效果呈现先优后劣的趋势；随着内切酶用量的增加，酶切效果呈现一直下降的趋势；随着酶切时间的增加，酶切效果呈现先优后劣再优的趋势。综上可知，DNA最适用量为300 ng，内切酶最适用量为1 U，酶切最佳时间为4 h。

条带1—8为CTAB区室法提取的猕猴桃基因组DNA；条带9—15为CTAB法提取的猕猴桃基因组DNA。图1　猕猴桃基因组DNA电泳图Fig.1　Electropherogram of genomic DNA of Actinidia chinenesis

2.3连接

由图3-A可知：第1，2，3，5和8号条带亮度较亮，拖带清晰，且片段大小在500 bp左右，说明连接效果较好。第4，6，7，9和10号条带亮度较暗，看不清有拖带，说明连接效果不理想。由图3-B可知，随着T4-DNA ligase用量的增加，连接效果呈现一直下降的趋势；随着adpter用量的增加，连接效果呈现一直上升的趋势；随着ATP用量的增加，连接效果呈现一直上升的趋势。由于图中没有一个表现最高值的转折点，所以，该试验是在一个区间中找最适值。所以在1～3 U区间中T4-DNA ligase最适用量为1 U；在0.5～1.5 μL区间中adpter最适用量为1.5 μL；在0～2 μL区间中ATP最适用量为2 μL。

图2　酶切产物电泳图(A)及酶切效果综合评价(B)Fig.2　Electropherogram of enzyme digestion (A) and comprehensive evaluation of enzyme digestion (B)

图3　连接产物电泳图(A)及连接效果综合评价(B)Fig.3　Electropherogram of ligation (A) and comprehensive evaluation of ligation (B)

2.4预扩增

由图4-A可知：预扩增的5个条带亮度都很明亮，拖带的分散也比较均匀，且片段大小在500 bp左右，说明预扩增效果比较好。由图4-B可知，随着预扩增引物用量的增加，预扩增效果呈现先劣后优再劣的趋势。综上可知，预扩增引物(100 μmol·L-1)最适用量为0.8 μL。

2.5选择性扩增

由图5-A可知：第13—18，33—41，44—50号条带在500 bp的位置呈现均匀的弥散，说明选择性扩增效果比较好。由图5-B可知：随着Taq酶用量的增加，选择性扩增效果呈现一直上升的趋势。综上可知，选择性扩增的最适Taq酶(5 000 U·mL-1)用量为0.25 μL。

2.6引物筛选

由图6可知：第9，14，30，41，43，45，59和60号谱带在500～700 bp条带数目较多且条带清晰，说明选择性扩增效果比较好。其他谱带有的条带很少，有的条带在800～1 000 bp，因此不做选择。根据电泳图选择的最好的谱带与引物对对比，从64对引物中筛选出E-AGG+M-CAT，E-ACT+M-CAG，E-AGG+M-CAG，E-ACG+M-CTG，E-AAG+M-CTG，E-ACG+M-CAA，E-AAG+M-CAA和E-ACG+M-CAG 8对条带数最多、条带最亮的引物组合。

2.7PAGE变性聚丙烯酰铵凝胶电泳

在PAGE变性聚丙烯酰铵凝胶电泳中，确定了PA胶的配比，即APS的最适用量为160 μL，TEMED最适用量为60 μL，所制胶板至少聚合4 h后再使用；在银染过程中确定了银染的最适时间为30 min，银染液的最适质量浓度为2 g·L-1；在显影过程中确定了显影液无水碳酸钠的最适用量为60 g·L-1，显影8 min左右条带最清晰。

图4　预扩增产物电泳图(A)和预扩增效果综合评价(B)Fig.4　Electropherogram of pre-amplification (A) and comprehensive evaluation of pre-amplification (B)

图5　选择性扩增产物电泳图(A)选择性扩增综合评价(B)Fig.5　Electropherogram of selective amplification (A) and comprehensive evaluation of selective amplification (B)

图6　引物筛选电泳图Fig.6　Electropherogram of primer selection

2.8组培苗的AFLP动态监测

对PAGE变性聚丙烯酰铵凝胶电泳后显影出的条带进行统计，并对筛选的8对引物对进行扩增反应，共得到494个条带，其中多态性条带为310条，多态性比例为62.7%。另外，在统计中发现R7，R8和R9 3代的变异系数很小，基本没有特异的条带，每对引物所对应的条带都很整齐。R10代有少量的特异性条带，R11代总条带数量较多，特异性条带的数量也较多，说明R11代的变异系数较大。继代次数与变异率关系如图7所示，R7，R8和R9代比较稳定，几乎没有发生变异，从R10代开始变异率随着继代次数的增加呈上升趋势。综上可知，猕猴桃组培苗继代到第9代还能较好地保持其遗传稳定性，从第10代开始发生了较多变异。

图7　继代次数与变异率的关系Fig.7　The relationship between subculture and variation rate

3　结论与讨论

本研究优化了猕猴桃多态性评价的AFLP体系，优化后的体系为：300 ng基因组DNA用内切酶酶切4 h，加入1 U T4-DNA ligase，1.5 μL adpter和2 μL ATP进行连接，预扩增引物(100 μmol·L-1)用量为0.8 μL，选择性扩增Taq酶(5 000 U·mL-1)用量为0.25 μL。

本研究从64对引物中筛选出E-AGG+M-CAT，E-ACT+M-CAG，E-AGG+M-CAG，E-ACG+M-CTG，E-AAG+M-CTG，E-ACG+M-CAA，E-AAG+M-CAA和E-ACG+M-CAG共8对扩增条带数最多、条带最亮的引物组合。这8对引物对能够对猕猴桃组培继代苗的多态性进行评价。所筛选的引物对与秦小波等[19]在西南特色猕猴桃的遗传多样性中所选的引物对有所差异，秦小波等是在256对选择性扩增引物对中筛选，而且所检测的样本也与本试验不同，因此，所选引物对会存在差异。

猕猴桃组培苗在继代增殖分化阶段会发生变异，变异植株的分子检测成了生产中急需解决的问题。同时工厂化大规模生产时无法对所有组培苗进行检测，因此确定猕猴桃能较好地保持其遗传稳定性的继代代数对大规模生产有重要意义。目前，国内外对品种的遗传变异监测主要通过植物形态学进行鉴定和分析，但是植株的很多基因水平的变异不全部表现在性状上，只有少数能够通过形态学分析鉴定出来，仅仅依靠形态学的观察往往很难做出准确的检测。本试验对猕猴桃继代7～11次的组培苗进行了动态监测，结果表明，猕猴桃组培苗继代到第9代还能较好保持其基因的遗传稳定性，但从第10代开始，随着继代次数的增加，变异率开始增大。

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(责任编辑侯春晓)

Construction of kiwifruit AFLP analysis system and dynamic monitoring of tissue culture variation of subculture seedling

LYU Tian-wen1， LI Wang-wei1， ZHANG Tai-kui1， LIU Hui-min1， LI Kun2,*

(1.CollegeofLifeSciences，SouthwestForestryUniversity，Kunming650224，China; 2.FacultyofInformationEngineeringandAutomation，KunmingUniversityofScienceandTechnology，Kunming650504，China)

In order to decrease the loss of variant seedlings in tissue culture， the variant rate of sub cultured seedlings of ‘Hort 16A’ was dynamically monitored by AFLPs in the study. The AFLP analysis system was set up and optimized， and the genetic diversity of 75 samples of R7-R11’s generations was studied too. The experiments showed that using 1 U restriction enzyme to digest 300 ng genomic DNA at 37 ℃ for 4 h in dual enzymes restriction could achieve the best effect. 1U T4 DNA ligase， 1.5 μL adpter and 2 μL ATP could get the best adpter ligation. The best dosage of pre-amplification primer was 0.8 μL (100 μmol·L-1) and that of the selective amplification ofTaqpolymerase was 0.25 (83 350 nkat·mL-1) μL. 8 pairs of primer whose number of amplified bands were the richest were selected. A total of 494 bands were amplified using these 8 pairs of primer， out of which 310 were polymorphic bands， and the polymorphic rate was 62.7%. The results showed that kiwi’s tissue subculture seedlings could maintain their genetic stability until the ninth generations. But from the tenth generation， the variant rate of sub cultured seedlings had an upward tendency.

kiwifruit(ActinidiachinenesisPlanch); AFLP analysis system; tissue culture variation ; subculture seedling; dynamic monitoring

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.12

2015-08-19

国家林业局948项目(2012-4-62)；国家星火计划项目(2013GA105005)；云南省教育厅科学研究基金项目(2014Y316)

吕天雯(1975—)，女，云南永善人，硕士，讲师，研究方向为生物技术。E-mail: 2442197585@qq.com

，李琨，E-mail: 1196972022@qq.com

S663.4

A

1004-1524(2016)04-0618-06

吕天雯， 栗望薇， 张太奎， 等. 猕猴桃AFLP分析体系的建立及其组培变异苗的动态检测[J]. 浙江农业学报， 2016， 28(4): 618-623.