6 w高强度跑台运动对大鼠关节软骨和关节滑液中基质金属蛋白酶-1、-3和-9的影响

刘绍东　张彦秋

(西安石油大学体育系，陕西　西安　710065)



6 w高强度跑台运动对大鼠关节软骨和关节滑液中基质金属蛋白酶-1、-3和-9的影响

刘绍东张彦秋

(西安石油大学体育系，陕西西安710065)

目的探讨高强度跑台运动对大鼠关节软骨和关节滑液中基质金属蛋白酶(MMP)-1、-3、-9的影响。方法选取30只雌性SD大鼠，随机分成对照组和高强度运动组，每组15只，其中高强度运动组进行6 w高强度跑台运动。6 w后处死所有动物，取大鼠膝关节滑液以及股骨内侧髁软骨组织，HE染色观察软骨病理学改变；酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠关节滑液中MMP-1、-3和-9蛋白的含量；Western印迹以及实时定量PCR法观察软骨组织中MMP-1、-3、-9蛋白和mRNA的表达。结果高强度运动组大鼠明显出现软骨损伤，并且关节滑液中MMP-1、-3、-9的蛋白水平明显高于对照组(P<0.05)；关节软骨中MMP-1、-3、-9的蛋白和mRNA水平明显高于对照组(P<0.05)。结论高强度运动可导致关节软骨损伤；而关节滑液和关节软骨中MMP-1、-3、-9的高表达很可能是高强度运动致关节软骨损伤的机制之一。

高强度运动；软骨损伤；基质金属蛋白酶；骨关节炎

高强度运动可以引起关节软骨的损伤，继而导致骨性关节炎(OA)的发生，给人们带来极大心理和经济负担〔1〕。研究表明，基质金属蛋白酶(MMP)-1、-3、-9在软骨损伤中发挥重要作用〔2〕。本实验利用跑台运动研究MMP-1、-3、-9是否在高强度运动引起的软骨损伤中发挥作用。

1　材料与方法

1.1实验对象及分组3月龄雌性SD大鼠30只(购于西安交通大学医学院实验动物中心)，体重(330±25)g；均饲养于西安交通大学医学院实验动物中心，自由摄食饮水，动物房温度维持在18℃～22℃，湿度维持在40%～60%，每日明暗时间均为12 h；所有动物在本实验前均未参加过跑台运动。

所有大鼠在适应性喂养1 w后开始在跑台上适应性运动训练3 d，跑台坡度为0°，速度为10 m/min，适应性训练时间为1次/d，10 min/次。高强度运动组大鼠(n=15)在适应性训练结束后休息2 d；然后根据Bedford等〔3〕的研究确定运动强度。正式跑台的坡度为0°，初始速度为10 m/min，并且在10 min内速度逐渐增加至28 m/min，并维持60 min。按照此运动方法1次/d，每周运动5 d，连续6 w。对照组大鼠(n=15)在笼内饲养，不参加跑台运动。所有动物6 w处死取材。

1.2苏木素-伊红(HE)染色取5只大鼠的左侧股骨内侧髁软骨组织，4%多聚甲醛固定、常规脱钙、石蜡包埋，4 μm连续切片。HE染色后置于光学显微镜下观察(×200)，每个组织均取1张切片，每张切片分别取3个不同视野观察软骨组织的病理学改变。

1.3RT-PCR分析每组选取5只大鼠，取其股骨内侧髁软骨组织，利用Trizol 试剂盒提取软骨组织总RNA，并反转录成cDNA。用SYBR Green 1 PCR mix试剂和ABI7300 实时定量PCR扩增仪进行扩增测定分析，并以软骨组织内β-actin的mRNA水平作为对照，利用2-△△Ct的方法进行各组基因表达的分析。引物序列见表1。

表1　实时定量PCR引物序列

1.4Western印迹分析每组选取5只大鼠，取其股骨内侧髁软骨组织，RIPA裂解液提取总蛋白，加入上样缓冲液，95℃静置10 min，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，上样量为20 μl/孔，电泳结束后将目的蛋白转移到PVDF膜上。室温条件下5 g/100 ml脱脂牛奶封闭2 h，加入MMP-1、MMP-3和MMP-9抗体(Abcam，美国)，4℃过夜。加入二抗室温孵育2 h，用化学增强发光法(ECL)发光试剂在暗室中行X线胶片曝光。β-actin作为内参对照。采用Image Pro图像分析软件进行灰度定量分析。

1.5酶联免疫吸附(ELISA)法按照ELISA试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)的说明书，取适量大鼠膝关节液检测膝关节滑液中MMP-1、-3、-9蛋白表达水平。

1.6统计学方法应用SPSS17.0软件行t检验。

2　结　果

2.1软骨HE染色结果对照组关节软骨表面光滑，表层细胞排列整齐、紧密，细胞核完整；各层细胞层次清楚，结构完整，软骨基质染色均匀，软骨基质内未见增生血管。高强度运动组软骨表面不再光滑，存在溃疡缺损和小的裂隙，细胞层次排列紊乱，并有簇集现象，软骨细胞整体减少，并且在软骨内可见灶性溶解、坏死。见图1。

图1　各组关节软骨HE染色结果(×200)

2.2关节滑液MMP-1、-3、-9的表达干预6 w后，高强度运动组关节滑液中MMP-1、-3、-9的表达(22.00±4.74、13.00±2.92、22.80±3.71)均明显高于对照组(14.80±3.89、8.00±2.24、16.60±2.30，P<0.05)。

2.3软骨MMP-1、-3、-9 mRNA表达干预6 w后，高强度运动组膝关节软骨中MMP-1、-3、-9的mRNA表达(1.90±0.32、2.30±0.45、2.12±0.35)均明显高于对照组(1.06±0.27、0.84±0.21、1.08±0.31，P<0.05)。

2.4软骨MMP-1、-3、-9蛋白表达干预6 w后，高强度运动组膝关节软骨中MMP-1、-3、-9蛋白的表达〔(73.00±10.65)%、(75.44±14.26)%、(75.80±11.95)%〕均明显高于对照组〔(30.80±6.49)%、(35.00±9.19)%、(31.40±10.86)%，P<0.05〕。见图2。

图2　各组关节软骨MMP-1、-3、-9蛋白的表达

3　讨　论

运动训练是增强运动员身体素质的主要途径，但是高强度的以及不恰当的运动会造成不同程度的机体损伤。在众多运动损伤中，关节软骨损伤较为常见〔2〕，并且关节软骨损伤后修复比较困难，其主要原因与软骨内血管、神经分布较少有关；因此，损伤早期及时有效的治疗对于关节软骨损伤的预后具有重要意义，若治疗不恰当或不及时会加速关节软骨蜕变，进而出现OA等慢性关节损伤性疾病。虽然对于软骨损伤目前临床中有较多的治疗方案，但是疗效不是很明显，这很可能是由两个原因造成的：①软骨组织中缺乏血管、神经等营养支持，损伤后难以自我修复；②目前对于高强度运动引起的软骨损伤的具体发病机制还不明确，导致缺乏针对性强的治疗方案。

软骨损伤是软骨合成和降解的失衡，而软骨基质主要由Ⅱ型胶原和蛋白聚糖组成。MMPs是降解软骨基质的重要的蛋白酶，所以MMPs表达的异常必然是软骨损伤的重要机制。研究发现MMP-1、-3、-9降解软骨基质的主要MMPs〔2〕。MMP-1已被证明可以降解关节软骨中Ⅱ胶原〔4〕，并且软骨分泌的MMP-1可以被立即分泌到关节滑液中，并弥散到关节软骨上，进一步造成关节软骨的破坏〔5〕。研究还表明MMP-1可以通过激活肿瘤坏死因子-α等炎症因子，从而加速关节软骨的破坏〔6〕。

MMP-3同样在关节软骨基质降解的过程中发挥重要作用。研究发现MMP-3可以降解蛋白聚糖、纤维连接素、层连蛋白、弹性蛋白等，并且可以激活MMP-1降解Ⅱ型胶原，最终使关节软骨抵抗外力的作用下降，进而导致关节软骨的损伤〔2〕。研究表明，血清MMP-3的增加与关节软骨的损伤呈正相关〔7〕，而阻断软骨中MMP-3的表达有利于软骨损伤的修复〔8〕。这些研究都说明MMP-3的表达在软骨损伤中起着重要作用。MMP-9同样是关节软骨基质降解的重要的蛋白酶。在损伤的关节软骨中，MMP-9的表达明显增高〔9〕。在类风湿关节炎的损伤软骨中，学者们同样观察到MMP-9的表达较正常对照组明显增高〔10〕。这些研究足以证明MMP-9在关节软骨基质降解的过程中发挥了不可替代的作用。

本实验应用跑台运动制成功制造出了高强度运动软骨损伤模型，并且进一步证明了MMP-1、-3、-9在高强度运动软骨损伤中的作用，为以后治疗关节软骨远动损伤提供了新的思路。

1于国辉.关节软骨运动损伤修复中的骨形态发生蛋白〔J〕.中国组织工程研究与临床康复,2010;14(46):8669-72.

2Ding L,Guo D,Homandberg GA,etal.A single blunt impact on cartilage promotes fibronectin fragmentation and upregulates cartilage degrading stromelysin-1/matrix metalloproteinase-3 in a bovine exVivo model 〔J〕.J Orthop Res,2014;32(6):811-8.

3Bedford TG,Tipton CM,Wilson NC,etal.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures〔J〕.J Appl Physiol Respir Envpir Exerc Physiol,1979;47(6):1278-83.

4陈蔚东，蒋青，陈东阳，等.P38阻断剂对鼠关节炎软骨细胞金属蛋白酶表达的作用〔J〕.中国医学科学院学报,2007;29(6)：777-81.

5Chen WP,Xiong Y,Shi YX,etal.Astaxanthin reduces matrix metalloproteinase expression in human chondrocytes〔J〕.Int Immunopharmacol,2014;19(1):174-7.

6Zhang D,Huang B,Xiong C,etal.Pinocembrin inhibits matrixmetalloproteinase expression in chondrocytes 〔J〕.IVBMB Life,2015;67(1):36-41.

7Kobayashi M,Squires GR,Mousa A,etal.Role of interleukin-1 and tumor necrosis factor alpha in matrix degradation of human osteoarthritic cartilage〔J〕.Arthritis Rheum,2005;52(1):128-35.

8Suganuma K,Nakajima H,Ohtsuki M,etal.Astaxanthin attenuates the UVA-induced up-regulation of matrix-metalloproteinase-1 and skin fibroblast elastase in human dermal fibroblasts〔J〕.J Dermatol Sci,2010;58(2):136-42.

9Tao R,Wang S,Xia X,etal.Pyrroloquinoline quinone slows down the progression of osteoarthritis by inhibiting nitric oxide production and metalloproteinase synthesis〔J〕.Inflammation,2015;38(4):1546-55.

10Pelttari K,Lorenz H,Boeuf S,etal.Secretion of matrix metalloproteinase-3 by expanded articular chondrocytes as a predictor of ectopic cartilage formation capacity in vivo〔J〕.Arthritis Rheumatism,2008;58(2):467-74.

〔2015-12-31修回〕

(编辑袁左鸣)

陕西省体育局常规课题基金资助项目(No.13044)

刘绍东(1960-)，男，副教授，主要从事体育教育和健身指导研究。

R68

A

1005-9202(2016)18-4415-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.005