人参总皂苷对β-淀粉样蛋白25～35诱导的海马神经细胞毒性的保护作用

张国双　王志涛　赵　琦　寻知元

(天津市安定医院，天津　300222)



人参总皂苷对β-淀粉样蛋白25～35诱导的海马神经细胞毒性的保护作用

张国双王志涛1赵琦2寻知元

(天津市安定医院，天津300222)

目的探讨人参总皂苷对β-淀粉样蛋白(Aβ25～35)诱导的海马神经细胞毒性的保护作用。方法建立大鼠海马神经细胞Aβ25～35损伤模型。通过Neurofilament染色，测定细胞毒性以及乳酸脱氢酶(LDH)活性考察人参总皂苷对Aβ25～35诱导的海马神经细胞毒性的保护作用；利用Hoechst33258进行免疫荧光染色实验，观察细胞形态，检测细胞凋亡情况；通过Fluo-3AM荧光探针技术在共聚焦显微镜下测定细胞内钙离子浓度 (〔Ca2+〕i)的变化情况。结果1.5 μmol/L Aβ25～35为造成神经细胞毒性的最佳浓度。人参总皂苷50 mg/L，100 mg/L以及200 mg/L对Aβ25～35诱导的海马神经细胞具有良好保护作用，呈现出一定的剂量依赖性。人参总皂苷100 mg/L可显著降低Aβ25～35诱导的神经细胞凋亡，可明显抑制Aβ25～35诱导的海马神经细胞〔Ca2+〕i的升高。结论人参总皂苷可有效保护海马神经细胞免受Aβ25～35毒性损伤，其作用机制与降低〔Ca2+〕i有关。

人参总皂苷；β-淀粉样蛋白(Aβ)25～35；海马神经细胞；细胞内钙离子浓度〔Ca2+〕i

阿尔茨海默病(AD)主要表现为记忆力减退、认知功能障碍、分析判断能力的下降、意识模糊和智力逐渐丧失、甚至人格改变，最终导致生活不能自理〔1〕。在65岁以上人群中，AD是继心血管病、肿瘤、脑卒中之后的第4位死亡原因〔2，3〕。AD发病早期的关键性环节是β-淀粉样前体蛋白(APP)分解代谢和β-淀粉样蛋白(Aβ)的异常释放和沉积〔4〕。目前，获得批准治疗AD的药物主要是有益于记忆和思维的，并不能够针对疾病的病因来治疗〔5〕。因此寻找从发病机制上能改善AD的药物非常有现实意义。体外原代培养海马细胞，采用Aβ25～35损伤海马细胞，可一定程度上模拟在体AD的发生机制。本实验旨在探讨人参总皂苷对Aβ25～35诱导的海马神经细胞毒性的保护作用。

1　资料与方法

1.1实验试剂Aβ25～35购自Sigma(美国)人参总皂苷购买于成都普瑞法生物有限公司(成都，中国)。

1.2动物、给药及分组雌性SD大鼠，体重200～220 g，孕期18 d，由天津大学动物实验中心提供。海马细胞生长至第7天后，取出海马细胞进行分别处理：①正常组，不加任何处理因素，换上同体积的新鲜的无血清DMEM培养基；②模型组，在每孔中加入Aβ25～35终浓度为1.5 μmol/L无血清DMEM培养基；③人参总皂苷组(含Aβ25～351.5 μmol/L)。每小组药物均用无血清DMEM培养液配制。置于37℃，5% CO2培养箱中培养24 h。

1.3细胞活性以及乳酸脱氢酶(LDH)活性测定向96孔板的每孔加入20 μl MTT(3 mg/ml)继续培养，4 h后吸弃上清，加入150 μl二甲基亚砜，充分振荡至晶体完全溶解，于酶标仪490 nm波长下测各孔的光密度值(OD)，并计算相对生存率。取各孔的细胞培养基，按照南京建成LDH试剂盒说明书操作，并在450 nm处测定各组吸光度值，计算各组培养基中LDH活性。

1.4Hoechst33258 染色方法培养海马神经细胞于第7天给药处理，分为正常组，模型组(Aβ25～351.5 μmol/L)，人参总皂苷组(20 μmol/L)给药处理24 h后开始免疫染色。按章立等〔6〕等方法操作，冷PBS清洗，4%多聚甲醛固定1 h。PBS清洗3次后，加5 mg/L Hoechst33258染色液染色30 min，PBS液清洗，封片液封片，在倒置荧光显微镜下观察。细胞核固缩或碎片分裂视为凋亡。于64× 镜下每片玻璃片随机取5个不同视野，计算细胞凋亡率(凋亡细胞数/总细胞数)。

1.5激光共聚焦测定细胞内钙离子(〔Ca2+〕i)浓度根据报道的实验方法测定海马细胞内钙离子浓度〔6〕。采用Fluo-3 AM荧光染色钙离子，激发光波长为488 nm左右，发射波长为525～530 nm测定〔Ca2+〕i。激光共聚焦皿培养神经细胞7 d，弃去培养液，PBS洗两遍，加入终浓度为5 μmol/L Fluo-3AM与D-Hank(无Ca2+)的混合液，负载45 min后，测定F值；加入Ionomycin终浓度为5 μmol/L测定Fmax；加入MnCl2终浓度为2 mmol/L测定Fmin，计算〔Ca2+〕i浓度。

1.6统计学处理采用SPSS17.0软件包进行t检验。

2　结　果

2.1Aβ25～35造成海马神经细胞损伤海马神经细胞在加入1.5 μmol/L Aβ25～355 h后，利用MTT法检测细胞相对生存率为(78.9±6.3)%。综合细胞形态学观察结果(图1)，选定Aβ25～351.5 μmol/L为神经细胞毒性模型的造模浓度。

2.2人参总皂苷对Aβ25～35诱导的海马神经细胞影响

2.2.1细胞形态学检测正常细胞核呈圆形或椭圆形；凋亡细胞核固缩或裂片。模型Aβ25～35组可见较多的细胞表现为核染色质凝集，致密浓染，细胞核染色质固缩或碎裂成2块以上。与模型组比较，人参皂苷保护组可以显著降低Aβ25～35处理后海马神经元的损伤，细胞形态有较好的恢复，呈现出与正常细胞类似的形态学(图2)。

2.2.2细胞凋亡率检测如图3所示：Hoechst33258荧光染色结果显示，正常细胞荧光着色浅；凋亡细胞呈强荧光反应。模型组可见荧光增强。与正常组细胞凋亡率〔(5.2±0.4)%〕及LDH活性〔(100.2±11.3)%〕相比，模型组细胞凋亡率〔(29.6±1.1)%〕以及LDH活性〔(259.3±19.2)%〕显著增加；由Aβ25～35所诱导的细胞凋亡以及LDH活性可显著地被100 mg/L人参总皂苷抑制。与模型组比较，人参总皂苷可以显著降低Aβ25～35处理后海马神经元的凋亡率〔(13.2±0.6)%〕和LDH活性〔(149.6±9.5)%〕。

2.2.3〔Ca2+〕i检测图4所示，与正常组比较〔(100.2±9.8)%〕1.5 μmol/L Aβ25～35使Fluo-3-Ca荧光显著增强〔(328.7±29.6)%〕，而人参总皂苷处理显著抑制了这种荧光增强〔(261.3±19.6)%〕。模型组对细胞损害较大，造成〔Ca2+〕i增高，而人参总皂苷能对Aβ25～35诱导神经细胞的损害具有较好的保护作用。

图1　Aβ25～35对海马神经细胞的损伤作用(Hoechst 33258染色，×64)

图2　人参总皂苷缓解Aβ25～35诱导的海马神经细胞损伤(Hoechst33258染色,×64)

图3　人参总皂苷对Aβ25～35诱导的海马神经细胞凋亡的影响(Hoechst 33258荧光染色，×64)

图4　人参总皂苷对Aβ25～35诱导的海马神经细胞〔Ca2+〕i的影响

3　讨　论

人参Panax ginseng C.A.Mey和西洋参P.quinquefolium L.是五加科人参属植物，具有“除邪气、补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、开心、益智”等功效〔7，8〕。人参总皂苷是人参、西洋参的主要活性提取组分，具有抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老和治疗老年性疾病引起的认知功能障碍等作用〔4，9，10〕。

AD发病早期的关键性环节是APP分解代谢和Aβ的异常释放和沉积〔4〕。Aβ25～35可造成DNA损伤等凋亡特征，因此选择Aβ25～35造成海马细胞毒性具有重要意义。染色质染色剂Hoechst33258荧光染色证明，1.5 μmol/L 的Aβ25～35使培养的海马神经细胞出现凋亡特征。人参总皂苷能有效地减少由Aβ25～35毒性产生的DNA碎片发生，降低神经细胞的凋亡率，对神经细胞具有保护作用。本实验结果提示人参总皂苷可通过抑制海马神经细胞的凋亡而降低Aβ25～35对海马神经细胞的毒性作用。〔Ca2+〕i浓度的升高被认为是凋亡的重要信号，研究表明抑制〔Ca2+〕i浓度的升高一定程度上可以防止细胞凋亡〔11，12〕。本研究表明人参总皂苷可平衡神经细胞内〔Ca2+〕i浓度，降低Aβ25～35诱导的海马神经细胞凋亡。

1宋晓征，李成杰，张子寅，等.维生素E对阿尔茨海默病患者血清中CD8/CD28表达水平的影响〔J〕.中国实用神经疾病杂志，2013;16(20)：48-9.

2Glenner GG，Wong CW.Alzheimer's disease and Down's syndrome：sharing of a unique cerebrovascular amyloid fibril protein〔J〕.Biochem Biophy Res Commun，1984;122(3)：1131-5.

3Miller DL，Papayannopoulos IA，Styles J，etal.Peptide compositions of the cerebrovascular and senile plaque core amyloid deposits of Alzheimer's disease〔J〕.Arch Biochem Biophy，1993;301(1)：41-52.

4苏心，张文治，吴剑娟.β-淀粉样蛋白对培养胎鼠大脑神经干细胞作用的研究〔J〕.中华老年心脑血管病杂志，2005;7(3)：192-5.

5Wang JZ，Grundke-Iqbal I，Iqbal K.Glycosylation of microtubule-associated protein tau：an abnormal posttranslational modification in Alzheimer's disease〔J〕.Nature Med，1996;2(8)：871-5.

6章立，李新荣，徐蘅，等.用Fluo3-AM测定2型糖尿病患者淋巴细胞内Ca2+浓度及药物对患者胞内Ca2+浓度的影响〔J〕.中国药科大学学报，1999;30(6)：451-5.

7谭世强，张爱华，许永华，等.人参总皂苷对粘虫体内蛋白质含量及消化酶活性的影响〔J〕.中国中药杂志，2013;38(11)：1692-6.

8魏建华，杨文志，刘强，等.人参饼干中人参总皂苷、人参单体皂苷Rb1及Re+Rg1含量测定及人参饼干中人参皂苷的定性鉴别〔J〕.人参研究,2013;(1)：31-3.

9潘爱珍，易伟民，余晓娟，等.人参总皂苷对脾虚模型大鼠的保护作用研究〔J〕.中国药房，2013;24(39)：3682-4.

10吕昕瞳，杨丹莉，邓江，等.人参总皂苷对血管紧张素Ⅱ所致乳大鼠心肌细胞肥大的抑制作用〔J〕.中国药理学与毒理学杂志，2013;27(4)：641-5.

11Emilsson L，Saetre P，Jazin E.Alzheimer′s disease：mRNA expression profiles of multiple patients show alterations of genes involved with calcium signaling〔J〕.Neurobiol Dis，2006;21(3)：618-25.

12Poon HF，Shepherd HM，Reed TT，etal.Proteomics analysis provides insight into caloric restriction mediated oxidation and expression of brain proteins associated with age-related impaired cellular processes：mitochondrial dysfunction，glutamate dysregulation and impaired protein synthesis〔J〕.Neurobiol Aging，2006;27(7)：1020-34.

〔2014-12-29修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

张国双(1979-)，男，副主任医师，主要从事精神医学临床研究。

R743

A

1005-9202(2016)18-4438-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.015

1天津医科大学总医院2天津市人民医院