SH-SY5Y神经细胞中α7神经型尼古丁受体基因过表达对CaMKⅡ和CREB的影响

吕园园，　张淑丽，　吴昌学，　王晓玲，　官志忠，2，　齐晓岚



SH-SY5Y神经细胞中α7神经型尼古丁受体基因过表达对CaMKⅡ和CREB的影响

吕园园1，张淑丽1，吴昌学1，王晓玲1，官志忠1，2，齐晓岚1

目的研究SH-SY5Y神经细胞中α7 nAChR基因过表达对CaMKⅡ和CREB的影响。方法复苏稳定转染α7 nAChR-pcDNA3.1质粒及空载质粒的SH-SY5Y神经细胞后，用含G418的培养液进行筛选培养；应用实时荧光定量PCR法和蛋白印迹法(Western blot)检测α7 nAChR基因过表达组、空载质粒组和正常对照组细胞中CaMKⅡ、CREB mRNA及蛋白表达水平的变化。结果与对照组相比，α7 nAChR基因过表达细胞组的CaMKⅡ、CREB mRNA表达水平分别增加了116.8%和114.7%(P<0.01)；及CaMKⅡ、CREB蛋白表达水平分别增加了8.7%(P>0.05)和41.4%(P<0.05)。结论α7 nAChR的神经保护作用可能与上调细胞CaMKⅡ、CREB水平有关。

α7 nAChR；SH-SY5Y细胞；CaMKⅡ；CREB

阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是一种主要在老年人群中发生的神经元退行性变疾病，临床特征以进行性痴呆为主，是导致老年人群残疾和死亡的主要病因。临床表现为渐进性的记忆障碍，认知能力衰退，智力和理解能力减弱，社会活动技能减退，最终失去自理能力。随着社会人口的老龄化，AD的发病率在逐年上升，给社会和家庭带来沉重的负担。自1906年德国医生Alois Alzheimer发现AD以来已经经历了100多年，但其具体的发病机制目前还不十分清楚。AD的病因很多，涉及由遗传、环境、代谢等因素相互影响致使的多种病理机制[1～3]。本课题组前期结果表明α7神经型尼古丁受体(Neuronal nicotinic receptor，nAChR)与大脑的学习记忆能力及认知能力有着密切的关系，能够对抗Aβ沉积引起的神经毒性，具有一定的神经保护作用[4]，但其分子机制仍不十分清楚。α7nAChR是离子通道型受体，能通透Ca2+，而钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(Calmodulin-binding protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)和环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP responsive element-binding protein，CREB)是钙信号转导通路下游重要的信号分子，对学习记忆、认知能力及突触可塑性有着重要的调节作用[5，6]。本文通过α7nAChR基因过表达对SH-SY5Y神经细胞中CaMKⅡ、CREB表达的影响来探究α7nAChR的神经保护作用机制。

1　材料与方法

1.1材料

来源于人脑的SH-SY5Y神经细胞由本课题组保存；稳定转染α7nAChR-pcDNA3.1质粒及空载质粒的SH-SY5Y神经细胞由本课题组冻存于液氮罐中；D-MEM培养液、双抗购于HyClone公司；胰酶、血清购于Gibco公司；Revert Aid First Strandc DNA Synthesis Kit、Trizol试剂购于Thermo公司(美国)；CaMKⅡ、CREB及内参照β-actin的模板引物由上海生工合成；鼠抗CaMKⅡ单克隆抗体(sc-13141)、鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体及标记辣根过氧化物酶(HRP)的抗鼠二抗均购于Santa Cruz Biotechnology公司(美国)；兔抗CREB单克隆抗体(GTX61140)购于Gene Tex(美国)；标记HRP的抗兔二抗购于CST(美国)；G418、Real time-PCR所用试剂购于Roche公司(德国)。高效显影胶片、聚乙烯二氟膜(PVDF)、ECL-Plus发光试剂均购于Amersham公司；显影液及定影液购于柯达公司；普通化学试剂均购于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养SH-SY5Y神经细胞为贴壁细胞，完全培养基包含DMEM高糖培养基，胎牛血清10%，双抗(青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml)1%；筛选培养基包含DMEM高糖培养基、胎牛血清15%、G418(浓度为0.8 mg/ml)；放于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。

1.2.2实时荧光定量PCR检测CaMKⅡ、CREB mRNA表达水平采用Trizol法提取SH-SY5Y细胞总RNA，再将RNA用PCR扩增逆转录成cDNA，然后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR。所用试剂为Faststart Universal SYBR Green Master(ROX)。其中CaMKⅡ、CREB以及内参照β-actin的引物序列见表1。运用ABI Step One Plus实时荧光定量PCR仪收集待测基因及内参照β-actin扩增循环的荧光信号，以Applied Biosystems SDS 2.1软件进行荧光收集和数据分析。SDS2.1软件分析其△△Ct值和RQ(relative quantity)值(RQ=2-△△Ct)。以β-actin为内参照分析结果，并计算CaMKⅡ、CREB和对照组mRNA相对表达水平。实验重复3次，每次3个复孔。

表1　待测基因的引物序列及扩增产物大小

1.2.3Westernblot检测CaMKⅡ和CREB蛋白表达水平收集细胞，用裂解法提取细胞总蛋白，用BCA法进行蛋白定量。用Westernblot检测CaMKⅡ、CREB蛋白表达水平，以β-actin作内参照。分析结果时用ImageJ软件，计算CaMKⅡ、CREB蛋白条带与β-actin蛋白条带像素灰度值的百分比作为蛋白表达水平。实验重复3次，每次3个复孔。

2　结　果

2.1α7nAChR基因过表达对SH-SY5Y细胞CaMKⅡ、CREB mRNA表达水平的影响

SH-SY5Y细胞α7nAChR基因过表达后，细胞CaMKⅡ、CREB mRNA表达水平分别增高了116.8%(见图1)及114.7%(见图2)，与对照组细胞相比差异有统计学意义(P<0.01)。而空载对照组与对照组细胞相比不具有差异性。说明α7 nAChR基因过表达能增加CaMKⅡ、CREB mRNA水平的表达。

2.2α7 nAChR基因过表达对SH-SY5Y细胞CaMKⅡ、CREB蛋白表达水平的影响

SH-SY5Y神经细胞α7 nAChR基因过表达后，细胞CaMKⅡ、CREB蛋白表达水平分别增加了8.7%(见图3A)及41.4%(见图3B)，CaMKⅡ蛋白表达水平与对照组细胞相比差异无统计学意义(P>0.05)；CREB蛋白表达水平与对照组细胞相比差异有统计学意义(P<0.05)。说明α7 nAChR过表达能增加CREB蛋白水平的表达，而对CaMKⅡ蛋白水平的表达无显著影响。

与对照组细胞相比差异有统计学意义**P<0.01

与对照组细胞相比差异有统计学意义**P<0.01

与对照组相比差异有统计学意义**P<0.05

3　讨　论

nAChR是第2信使非依赖性、门控性离子通道型受体，可与神经递质结合，本身也是离子通道，其开放不需要第2信使的参与。nAChR由2种亚基α和β组成，不同的亚基以不同的组合形式组成不同五聚体结构的尼古丁受体亚型，主要调控细胞内外Na+、K+和Ca2+等离子的流动[7]。在SH-SY5Y细胞中α7nAChR是主要的受体亚型之一，其减少与AD的发病有关。α7 nAChR可通过协助第二信使Ca2+参与调控神经系统兴奋性、神经递质释放、长时程增强效应(long-termpotentiation，LTP)的诱导以及学习记忆能力。在AD患者中α7nAChR的激活也能改善患者的学习记忆能力以及注意力，是一类具有明确神经保护作用的受体[8]。Ca2+作为胞浆第二信使可通过α7 nAChR与CaM相结合形成Ca2+-CaM复合物，Ca2+-CaM作用于CaMKⅡ使其磷酸化而被激活，激活的CaMKⅡ(Phosphorylation of CaMKⅡ，pCaMKⅡ)作用于下游的信号分子[9]。在神经系统中，CaMKⅡ主要分布于海马和大脑皮质的胞体、树突及轴突中；而CaMKⅡ是海马内突触后致密物(Post-synapticdensity，PSD)的主要成分之一，影响突触的发生及树突、轴突的形成，从而调控神经递质的释放和突触的改变，诱导LTP的产生，与学习和记忆功能有关[10～12]。CaMKⅡ是一种多功能丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，活化后的CaMKⅡ(pCaMKⅡ)与CaM的亲和性增加，并使相关激酶转为Ca2+/CaM非依赖形式，从而作用于突触后膜上其他蛋白并使其磷酸化，最终形成LTP[13]。本研究结果表明α7 nAChR过表达能上调CaMKⅡmRNA，但对CaMKⅡ蛋白水平的表达影响不大，可能是因为α7 nAChR过表达使Ca2+内流增加，CaM相对增加，活化状态的pCaMKⅡ增加而使CaMKⅡ相对减少；本实验后期将对pCaMKⅡ进行研究。而CaMKⅡ作为Ca2+-CaM-CaMKⅡ信号转导通路下游信号分子，在调节学习记忆和突触可塑性中的作用是十分重要的。

CREB作为CaMKⅡ下游信号分子，在调节突触可塑性中发挥显著作用[14]。CREB是一种核转录因子蛋白，能使短时程记忆转变为长时程记忆，促进形成长时程记忆及活化与长时程记忆相关蛋白的表达。而CREB的激活可促进与突触可塑性相关因子的转录，从而诱导多种与学习记忆相关蛋白的产生[15]。本研究的结果表明α7 nAChR基因过表达可使CREB蛋白的表达水平增加，可能是α7 nAChR过表达促使钙信号通路相关蛋白的表达，从而作用于下游的信号分子CREB，其蛋白水平的改变可影响神经递质的传递和突触的可塑性，从而影响学习记忆能力和认知功能。本实验结果表明α7 nAChR基因过表达可通过影响CaMKⅡ、CREB的表达而影响学习记忆能力。这提示了激活α7 nAChR可能会缓解AD患者的学习认知能力，为临床预防和治疗AD提供一定的理论参考依据。

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Effects of α7 neuronal nicotinic receptor gene overexpression in SH-SY5Y cells on the levels of CaMKⅡand CREB

LVYuanyuan，ZHANGShuli，WUChangxue，etal.

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，China)

ObjectiveTo study the effects of α7 nAChR gene overexpression on the levels of CaMKⅡand CREB in SH-SY5Y cells. MethodSH-SY5Y cells were transfected with α7 nAChR-pcDNA3.1 plasmid，the stable clones were cultivated with culture medium containing G418.Real-time PCR and Western blot were used to detect the mRNA and protein levels of CaMKⅡand CREB，respectively；ResultsCompared to negative controls and controls，SH-SY5Y with α7 nAChR gene overexpression increased the mRNA levels of CaMKⅡand CREB by 116.8% and 114.7%，respectively；increased the protein levels of CaMKⅡand CREB by 8.7% and 41.4%，respectively. ConclusionNeuroprotective effect of α7 nAChR may be related to up-regulation of CaMKⅡand CREB levels.

α7 nAChR；SH-SY5Y cells；CaMKⅡ；CREB

1003-2754(2016)09-0772-04

2016-05-05；

2016-08-31

国家自然科学基金资助项目(81360178)，教育部“长江学者和创新团队发展计划资助”(IRT13058)，贵州省科技厅重大专项(黔科合重大专项字2014[6008])，贵州省科技厅项目(201344，黔科合SY字[2013]3020)

(1.贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学病理学教研室，贵州 贵阳 550004)

齐晓岚，E-mail：xiaolan76@163.com

Q51；R749.1*6

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