滩羊种质资源细胞库的构建及细胞的生物学鉴定

令世鑫，马桂兰，徐水林，王家敏，马忠仁，乔自林*

（1.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州　730030；

2.兰州民海生物工程有限公司，甘肃兰州　730010）

滩羊种质资源细胞库的构建及细胞的生物学鉴定

令世鑫1，马桂兰2，徐水林2，王家敏1，马忠仁1，乔自林1*

（1.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；

2.兰州民海生物工程有限公司，甘肃兰州730010）

目的：通过对滩羊体细胞的体外分离培养和保存，在细胞水平上保存其种质资源。方法：用胰蛋白酶消化分离培养肾和睾丸组织的原代细胞，用组织块法培养耳缘组织的原代细胞，经传代扩大培养后在液氮中保存。细胞复苏后进行了活力、形态、生长特性和微生物污染的检查。结果：滩羊肾、睾丸和耳缘组织的原代细胞生长良好，细胞冻存后复苏检查的细胞活力在91.12%～97.74%，细胞形态和长势良好，生长曲线呈近“S”型曲线，最大增殖浓度为在2.12～3.19×105/ml，倍增时间在24.62～28.1 h，细菌、真菌、支原体和病毒检查为阴性。结论：滩羊的种质资源细胞库成功构建，使这一物种的种质资源在细胞水平上得到保存。

滩羊；种质资源；细胞库；鉴定

滩羊属蒙古羊，是我国独特的裘皮羊品种，以“二毛皮，九道湾”驰名中外，主要产于宁夏贺兰山东麓的银川市及甘肃环县、靖远、景泰、白银、皋兰等附近各县。滩羊长期在西北荒漠或半荒漠地区放牧形成的耐干旱、耐盐碱、耐粗饲、强抗病性及强抗逆性等特征，且具有优良的遗传稳定性，是国家二级保护品种。自从国家实行封山禁牧政策以来，滩羊由完全的放牧模式转变为圈羊，使其生存条件发生改变，加之没有系统开展科学的繁育饲养模式，品种退化现象较严重［1］。在实施国家自然科技资源共享平台项目《畜禽种质资源收集、整理与保存》以来，先后有几百个品种的家养和野生畜禽的种质资源在细胞或基因水平上得到了长期保存。通过对滩羊体细胞的分离、培养、保存和鉴定，在细胞水平长期保存了该优良地方品种遗传资源同时，也为该品种基因组文库构建和遗传多样性研究提供生物学材料。

1　材料

滩羊肾、睾丸和耳缘组织采自甘肃靖远某屠宰场，DMEM与胰蛋白酶（Gibco）、胎牛血清（兰州民海生物，添加比例为10%）、DMSO（ThermoFisher）、无菌和支原体检查培养基（北京三药）、Hoechst33258（Sigma）、病毒检查用Vero细胞和牛肾原代细胞（本室保存）、鸡和豚鼠红细胞等。

主要仪器设备有CO2培养箱（Thermo，3111型）、倒置相差显微镜（Olympus，CK40-32PH型）、荧光倒置相差显微镜（Olympus，IX71型）、液氮罐（乐山东亚）等。

2　方法

2.1样品采集及处理

选择精神状态良好、膘肥体健的30～50日龄滩羊羔羊经颈动脉放血处死，在剥皮之前，用手确定两个睾丸都在阴囊中时，用线绳扎紧阴囊，使从结扎1 cm处剪取时睾丸在阴囊中并保持无菌，切口用碘伏反复消毒后放进消毒好的样品袋中并标记。剖腹后连同包裹的脂肪一起摘取肾脏，且保留2 cm以上的血管和输尿管，在干净的开口容器内放置待脂肪固化后装入自封袋，标记性别。割下整个耳朵，装入自封袋，标记性别。所有组织装入事先放有冰块的样品箱，宰后6 h内带回实验室。共采集了20个个体的肾和耳朵，公母各半，10个个体的睾丸。

2.2原代培养

按文献方法采用胰蛋白酶消化法分离培养肾和睾丸组织细胞［2］，用组织块法培养耳缘组织细胞［3］。

2.3传代培养和冻存

生长致密的单层原代细胞用胰蛋白酶消化传代培养，其中肾和睾丸组织细胞以1∶3比例分种，耳缘细胞第一次传代按1∶2比例，其后按1∶3比例分种培养。待细胞扩大培养至总量达2×107以上时采用常规方法在液氮中保存（-196℃），用冻存保护液（10%DMSO+20%胎牛血清+70%DEMEM）调整细胞密度至2× 106～3.0×106/ml。

2.4细胞复苏及活力检查

从液氮中取出细胞冻存管，在39℃左右的水浴中快速解冻，用培养液悬浮细胞后800 r/min，10 min，弃上清，细胞沉淀用培养液重新悬浮后以2.0×105/ml左右接种培养，并用台盼蓝染色法检查细胞活力。

2.5生长曲线

将复苏培养的细胞传代一次培养到单层用胰蛋白酶消化，用培养液调整浓度至1.0×104/ml，接种到24孔培养板，每孔1 ml，置37℃5%CO2，每隔24 h取3孔细胞进行消化计数求平均值，直至细胞密度降低为止，用培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标绘制生长曲线并求得最大增殖浓度和倍增时间。

2.6细菌、真菌和支原体污染检查

按文献所述方法进行［4］。

2.7病毒检测

运用细胞培养法对复苏培养一代的细胞检查非血吸附病毒和血吸附病毒［5］。

3　结果

3.1原代培养

滩羊肾组织消化培养的原代细胞从第3天起可见大部分培养瓶中有较多的细胞贴壁分裂生长，第4天在培养瓶生长面70%以上长满了细胞，多为长梭形和多角形型细胞，第6天细胞成较致密单层，以长梭形为主（如图1A和1B）。

图1　滩羊肾细胞（A原代4d，10XB原代6d，20XC传代第1代72h，10XD复苏第1代72h，20X）

滩羊睾丸组织消化培养的原代细胞生长比肾组织的原代细胞要快，培养2 d时可见有细胞分裂生长，第4天生长面90%以上长满了细胞，细胞以长梭形和多

角形细胞为主（如图2A和2B）。

图2　滩羊睾丸细胞（A原代2d，20XB原代4d，20XC传代第1代48h，10XD复苏第1代48h，20X）

滩羊耳缘组织块法培养时第5天有部分组织块附近有大量细胞长出，第7天时有明显致密的单层细胞，细胞均呈长梭形，形态整齐均匀（如图3A和3B）。

图3　滩羊耳缘细胞（A原代5d，10XB原代7d，10XC传代第1代48h，20XD复苏第1代48h，20X）

3.2传代培养和冻存

滩羊肾组织原代细胞按1∶3传代后72 h可形成致密的单层细胞，视野内可见成片的上皮型细胞区（如图1C）；睾丸组织细胞按1∶3传代后48 h可形成单层细胞，细胞形态规则整齐，有似“水流样”和“漩涡状”走向（如图2C）；耳缘组织细胞首次按1∶2传代后48 h也能形成单层，以长梭形细胞为主，细胞间隙比肾细胞和睾丸细胞大，其后按1∶3传代生长速度变快，48 h形成单层细胞（如图3C）。

3.3复苏和活力检查

滩羊肾、睾丸和耳缘组织细胞的平均复苏活力为94.48%、91.12%和97.74%。复苏后肾细胞在72h形成致密单层（如图1D）；睾丸和耳缘组织细胞48h形成单层（如图2D和3D），细胞长势均良好，可连续培养5代以上。

3.4生长曲线

图4　滩羊体细胞的生长曲线图

三种细胞的生长曲线均呈“S”型（如图4），肾、睾丸和耳缘细胞的最大增值浓度为2.82×105/ml、2.12×105/ml和3.19×105/ml，倍增时间为25.53h、28.1h和24.62h。

3.5细菌、真菌和支原体检查

培养细胞的培养基检查细菌和真菌，培养7 d均没有菌生长；在支原体液体基中培养14 d颜色没有变化，在固体培养基中培养14 d也没有菌落生长；细胞冻融处理的上清液接种Vero细胞上用Hoechst 33258染色后只观察到细胞核有蓝色荧光，其它部位没有荧光。3.6病毒检测

在原代与传代培养过程中，利用倒置相差显微镜观察未见病毒引起的细胞病变；将细胞培养物分别接种到Vero和牛肾原代细胞培养21 d，看不到细胞病变现象；鸡和豚鼠红细胞吸附试验为阴性。

4　结论

畜禽种质资源是大自然留给人类的宝贵财富，是保障人类良好生存环境和衣食住行必不可少的物质，是关系到一个国家和民族竞争力的重要战略物资，收集和研究各种畜禽种质资源，建设各类国家种质资源库，建立功能基因开发和利用的国家基础条件共享平台具有重要的社会价值。滩羊为国家二级保护动物，是2001年被农业部列入第一批畜禽品种保护名录，其品质退化严重已是不争的事实。通过种质资源细胞库的构建使这一重要的种质遗传资源在细胞水平上得以保存下来，也为相关遗传学研究提供了有效的理论依据和理想的生物材料。

［1］郭天芬，高雅琴，刘庆霞，等.滩羊产业现状分析及发展建议［J］.畜牧兽医科技信息，2007，（05）：10-11.

［2］令世鑫，徐水林，马伟等.兰州黑白花奶牛肾组织细胞系的建立［J］.甘肃畜牧兽医，2016，46（5）：68-69，72.

［3］乔自林，冯玉萍，李明生，等.兰州大尾羊耳缘组织成纤维细胞系的建立［J］.黑龙江农业科学2012，（10），64-68.

［4］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典三部2010年版［M］.北京：中国农业出版社，2011.

［5］国家药典委员会.中国人民共和国药典三部2010年版［M］.北京：中国医药科技出版社，2010.

（编辑：高真贞）

Q954.6-3

B

1006-799X（2016）15-0092-02

国家科技基础条件平台-家养动物平台，西北民族大学中央高校基本科研业务费专项资金项目（zyp2015）

令世鑫（1966-），男，甘肃通渭人，工程师，主要从事家养动物种质资源保护利用工作。

乔自林（1976-），男，甘肃永靖人，高级实验师，研究方向为动物细胞培养技术。