鸭肝炎病毒的分离与检测

杨海山

（湛江市动物疫病预防控制中心，广东　湛江　524037）

鸭肝炎病毒的分离与检测

杨海山

（湛江市动物疫病预防控制中心，广东湛江524037）

在某养鸭场的雏鸭群当中出现了传染性疾病，其主要的临床特征表现为肝脏出血以及角弓反张，初步判断为鸭肝炎病毒感染症状。针对送行检测的病料采用无鸭肝炎病毒母源抗体的鸭胚实行病毒分离及检测。检测结果表明，接种病料的鸭胚均致死，且死亡鸭胚均出现了水肿、全身性出血等症状；采取解剖检验能够明显的观察到鸭内脏有明显的充血情况。在所采取的PCR扩增检测中得到了和预期大小相一致的440bp目的片段。基因测序的结果表明扩增出的基因部分和鸭肝炎病毒的同源性达到了98.5%，据此表明这一鸭群确认感染了鸭肝炎病毒。

鸭肝炎病毒；分离；检测；PCR

鸭肝炎病毒具有十分迅速的传播速度，能够在短时间之内便致使雏鸭死亡，是一种常见于雏鸭群的恶性传染病毒［1］。这一传染病毒现已成为了威胁养鸭行业的主要疾病之一。在目前的鸭肝炎病毒类型当中，主要包括I型、II型、III型三种类型，其中尤其是以I型的传播范围最广，传染性最强。本次研究以某养鸭场雏鸭群为研究对象，此雏鸭群在发病初期病鸭主要表现为精神萎靡、食欲降低或抵制进食，同时还存在有部分雏鸭出现了“角弓反张”的情况；对其进行病理性解剖观察，发现其肝脏大多已经出现出血性坏死，为了更进一步予以确诊，针对所有的送检病料均采用无母源抗体鸭胚实施病毒分离，同时采用PCR方法予以检测。

1　材料与方法

1.1检验材料

1.1.1病料及鸭胚

本次研究所采用病料均为某养鸭场疑似感染鸭肝炎病毒，而致死的7～9日龄雏鸭肝脏。而鸭胚选取某未注射鸭肝炎病毒疫苗的健康母鸭种蛋。

1.1.2毒株

对于鸭肝炎病毒强毒株采用实验室分离及检测后予以妥善储存［2］。

1.1.3检测试剂

Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Mar ker、Agarose Gel、DNA Extraction Kit以及蛋白酶K为宝生物工程有限公司生产，而RNA提取试剂Trizol reagent则由Invitrogen公司所生产；DEPC则由Amresco公司所生产；其余检测试剂均为国产分析纯［3］。

1.2检测方法

1.2.1病料处理

将所收集到的疑似出现鸭肝炎病毒的鸭肝脏病灶放入灭菌研磨设备当中，同时添加5被含有抗生素物质PBS液体研成粉末状，使之呈现出混浊悬浮液之后持续冻融三次以上，采用8 000 r/min离心设备进行10 min以上的离心处理，在提取到上层离清液之后增加以双抗，同时采用密度为0.22 μm滤网膜进行细菌过滤，将其保存于环境温度为-20 ℃的条件下。

1.2.2病毒分离

将处理完成的病料滤除液体依据0.2 mL/个的接种数量进行接种，而后将接种完成的鸭胚继续放置于37 ℃的环境之下予以继续孵化，而后照胚3次/d，将病死鸭胚放置于3 ℃的冰箱3.5 h左右使其血管发生收缩反应，从而得到尿囊液。

1.2.3PCR扩增

PCR扩增过程依据相关的标准流程予以操作，将其通过扩增所生成的物质借助于浓度比例为1%的琼脂糖凝胶电泳予以测定。

1.2.4基因测序

依据PCR扩增所取得特异性物质，对其予以纯化回收而送至相关的生物公司予以基因测序，并通过基因测序所得到的结果利用DNA Star软件予以比对分析。

2　结果

2.1病毒分离

在对鸭胚进行鸭肝炎病毒接种之后的95 h之内发生死亡情况，在对死亡鸭胚进行解剖检验时可明显发现其胚体存在严重的充血及出血情况，且与正常的鸭胚相比还存在明显的发育不良情况。详见下图1。

图1　死亡胚体充血和出血（中间为正常胚体）

2.2PCR扩增结果

经电泳检测结果表明，采用专门针对I型鸭肝炎病毒的P1、P2引物由待检样品以及标准I型鸭肝炎病毒的核算模板之中均扩增出了440bp的特异性条带状物质，而由正常的鸭胚尿囊液核酸模板之中则未扩增出相关的特异性条带状物质；采用其他引物也未能够在待检样本当中扩增出任何的条带状物质。

2.3基因测序及分析

在通过基因测序所得到的440bp，以及和PCR特异性扩增片段大小完全一样。将之与现已明确的I型鸭肝炎病毒基因开展BLAST对比分析。其分析结果证实，此次研究所分离出的病毒主体基因同核苷酸序列以及参考注的同源性达到了95.2%～98.5%之间，并且与C80株体之间的相似性最为接近，达到了98.5%。

综合以上研究结果证实，明确了本次研究所检测的鸭肝炎病毒为I型鸭肝炎病毒。

3　讨论

I型鸭肝炎病毒最初是一种从属于RNA病毒科的肠病毒属成员。在之后的研究当中发现鸭肝炎病毒与小RNA病毒科的9项已知属23类病毒间的衣壳蛋白与保守的2C及3D蛋白氨基酸序列间的同源性均低于40%，因此其从属于小RNA病毒科当中的一项新属内容，因此国际病毒分类委员会便将小RNA病毒命名为禽肝病毒属。此种类型病毒的大小一般为30 nm左右，没有囊膜，同时相应的基因组共被划分为单分子线状正链RNA，其中包含有VP1、VP2以及VP3三类完全不同的蛋白结构［4］。在此当中VP1存在有多项免疫辅助优势特性，其中T细胞的抗原位点和抗原的决定簇所共同构成了T、B淋巴细胞抗原为，并进一步诱导机体产生中和抗体，同时其同病毒基因型以及血清型之间存在有密切的相关性。因而，VP1较常会被应用于病毒遗传变异分子的主要参考依据。鸭肝炎病毒对于乙醚、胰蛋白酶以及一些常用的消毒剂具备有一定的耐药性，其能够在酸性值为3.0的环境下正常生存，并且结尾稳定。I型鸭肝炎病毒无法凝集任何动物或是人体的红细胞，但是其会在鸭、鸡、鹅等幼体胚胎的绒毛尿囊腔当中产生繁殖。鸭肝炎病毒是目前对养鸭业造成最大威胁的传染病症。因为这一病症所主要传染致死的主要是幼龄雏鸭，并且其传播速度十分迅速，具有高病发率、高致死率的显著特点，对于广大的养殖户而言由此所导致的经济损失十分巨大。通常而言，依据流行病学、临床特征以及相关的解剖检验特征，可针对雏鸭所感染的传染病症作出初步的判断。然而，近些年来在我国主要的鸭养殖地区已经出现了不少的新型鸭肝炎病毒时间，同时新型的鸭肝炎病毒症状亦可引起相似的临床表征及病理性改变。对此，就实施以相关的病毒性鸭肝炎研究工作便具有极其重要的作用与价值。

当前临床上应用在I型鸭肝炎病毒的抗原检测方法较为多样，例如较为常用的例如病毒中和试验、免疫电镜检查、酶联免疫吸附试验以及琼脂扩散试验等。在此之中应用最为普遍也是最为简便的即为中和试验，正是基于在鸭肝炎病毒检验工作当中的简便性，促使其被经常性的应用在了雏鸭病毒型肝炎以及相关的血清检验当中，然而这一方法同时也存在有明显的缺陷与不足，即为在对病原体进行分离之时需要进行长时间的离心分离，时间耗费较长，因而难以应用在大批量次的样品测定工作当中，同时再加之对于无母源抗体鸭胚应用也存在有一定的困难性，因而这一检测方式无法难以满足于临床上的快速诊治需求。

本次试验所选用的PCR扩增方法成功扩增出了和预期大小相等的440bp目的片段，借助于对扩增片段所开展的测序工作以及相应的BLAST分析工作，明确了该养鸭场所送检的病料为I型鸭肝炎病毒感染，因而采用PCR测定方法进行雏鸭肝炎病毒的检测工作是一种较为快速、有效的实验室检测方法。PCR诊断方法的运用对于鸭肝炎病毒发病区域的诊治工作具有十分明显的指导意义，能够为开展积极有效的防治措施提供以必要的参考依据，并将广大养鸭户的经济损失降低最低，具有十分明显的现实意义。

［1］苏敬良，黄瑜，贺荣莲，等.新型鸭肝炎病毒的分离及初步鉴定［J］.中国兽医科技，2014，（32）：15-16.

［2］刘伟，崔国杰，陈少莺，等.新型鸭呼肠孤病毒和鸭肝炎病毒混合感染的诊断及病原分离［J］.畜牧与兽医，2014，（46）：92-95.

［3］王永娟，李碧春，沈明君，等.抗Ⅰ型鸭肝炎病毒RdRp蛋白噬菌体单链抗体库构建及单链抗体的淘选［J］.中国预防兽医学报，2015，（37）：334-338.

［4］董井泉，张蕾，马波，等.Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白优势抗原区的鉴定及抗体检测ELISA方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2014，（36）：542-546.

（编辑：尹 云）

S852.65

B

1006-799X（2016）14-0091-02

杨海山（1973-），男，广东湛江人，助理兽医师，主要研究方向为兽医治疗。