高效液相色谱法测定气血宁口服液中阿魏酸含量＊

林晓春，翁立冬，郑锦坤，李旭桂，黄升昌，林晓佳

（1.广东省粤北人民医院，广东韶关512026;2.南方医科大学，广东广州510515）

高效液相色谱法测定气血宁口服液中阿魏酸含量＊

林晓春1，翁立冬2，郑锦坤1，李旭桂1，黄升昌1，林晓佳2

（1.广东省粤北人民医院，广东韶关512026;2.南方医科大学，广东广州510515）

目的建立测定气血宁口服液中阿魏酸含量的高效液相色谱(HPLC)法。方法色谱柱采用Kromasil HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83），流速为1.0 mL/min，检测波长为316 nm，柱温为20℃。结果阿魏酸进样量在0.02～0.10 μg范围内与峰面积呈现良好的线性关系(r=0.999 9);平均加样回收率为99.64%，RSD为1.04%(n=6);阿魏酸含量检测平均结果为0.014 4 g/L。结论该法操作简便、结果准确、重复性良好，可作为气血宁口服液中阿魏酸含量控制方法。

气血宁口服液;高效液相色谱法;阿魏酸;含量测定

气血宁口服液原名八珍口服液，由党参、熟地黄、白术（炒）、茯苓、当归、白芍、川芎、益母草、甘草等9味药材组方，是广东省食品药品监督管理局批准的医疗机构制剂(粤药制字Z20071531)，有着20多年的临床实践基础。该制剂是粤北人民医院特色医院制剂，能调补气血，临床用于由气弱血亏引起的形容憔悴、四肢倦怠及妇女月经不调、痛经等［1-2］。气血宁口服液是在古方“八珍汤”基础上按中医药传统理论调配，方中当归甘、辛、温，归肝、心、脾经，功能补血活血、调经止痛、润肠通便［3］;川芎辛、温，归肝、胆、心包经，功能活血行气、祛风止痛［4］。阿魏酸是当归、川芎的主要活性成分之一，具有多种药理作用，如抗炎、止痛、抗血栓形成、扩张微血管、防止血压升高等［5-6］。前期研究中，以高效液相色谱(HPLC)法测定芍药苷含量和甘草、白术的薄层鉴别作为质量控制的指标［7-8］。本试验中采用HPLC法测定气血宁口服液中阿魏酸的含量，以完善制剂的质量控制指标。现报道如下。

1　仪器与试药

1.1仪器

1260型高效液相色谱仪(Agilent科技有限公司); Cp225D型电子天平(德国赛多利斯公司);1810D型自动双重纯水蒸馏器(上海申生科技有限公司)。

1.2试药

气血宁口服液(批号为20120201，20120716，20121126，20130423，20130608，20131031，20131230，20140227，由粤北人民医院制剂室提供);阿魏酸对照品(批号为110773-201313，中国食品药品检定研究院);乙腈(色谱纯，德国默克公司)，乙酸乙酯、乙醚、石油醚、甲醇、乙醇、磷酸等均为分析纯(天津市福晨化学试剂厂)，水为双蒸水。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱:Kromasil HC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;检测波长:316 nm;流速:1.0 mL/min;流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83）;柱温:20℃;进样量: 10 μL。按阿魏酸峰计算，理论板数应不低于5 000。

2.2溶液制备

2.2.1供试品溶液

精密量取气血宁口服液4 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.2.2对照品溶液

取适量阿魏酸对照品，精密称定，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得质量浓度为0.02 g/L芍药苷对照品溶液。

2.2.3阴性对照品溶液

按气血宁口服液处方中药材比例，称取当归、川芎以外的处方药材并按生产工艺制备缺当归、川芎的阴性样品，按2.2.1项方法，制备缺当归、川芎的阴性对照品溶液。

2.3方法学考察

专属性试验:按拟订色谱条件，取阿魏酸对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μL进样。结果阿魏酸对照品溶液与供试品溶液色谱相应的位置上有相同保留时间的色谱峰，而阴性对照品溶液在此保留时间无对应色谱峰。色谱图见图1。

图1　高效液相色谱图

线性关系考察:按拟订色谱条件，取阿魏酸对照品溶液1，2，3，4，5 μL，分别进样测定并记录相应峰面积。以阿魏酸进样量（m，μg)为横坐标、相应的峰面积（S）为纵坐标进行线性回归，得回归方程S=13 563m+0.83 (r=0.9999)。结果表明，阿魏酸进样量在0.02～0.10 μg范围内与峰面积有良好的线性关系。

精密度试验:精密吸取同一阿魏酸对照品溶液，按拟订色谱条件进样10 μL，测定阿魏酸峰面积，重复进样6次。结果见表1，阿魏酸峰面积的RSD为0.76% (n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:精密吸取同一供试品溶液（批号为20131230）4.0 mL，按拟订色谱条件，于0，6，12，18，24 h时分别进样10 μL测定。结果见表2，阿魏酸峰面积的RSD为1.13%(n=5)，表明24 h内供试品溶液稳定性良好。

表1　精密度试验结果(n=6)

表2　稳定性试验结果(n=6)

重复性试验:取同一批样品（批号为20131230）6份，各4.0 mL，按供试品溶液的制备方法制备。按拟订色谱条件，测定样品中阿魏酸的峰面积并计算相应的阿魏酸含量。结果见表3，阿魏酸含量的RSD为0.97%(n=6)，表明该方法重复性良好。

表3　重复性试验结果(n=6)

加样回收试验:精密量取样品（含量为0.021 5 g/L，批号为20131230）2 mL，分别置10 mL容量瓶中，精密加入阿魏酸对照品溶液(含阿魏酸0.04 mg)2 mL，并按供试品溶液制备方法制备溶液，按拟订色谱条件测定阿魏酸含量。结果见表4。

表4　加样回收试验结果(n=6)

2.4样品含量测定

取样品8批，按供试品溶液的制备方法，按拟订色谱条件测定溶液中阿魏酸含量。结果见表5。

表5　各批样品中阿魏酸含量测定结果

3　讨论

3.1流动相选择

阿魏酸为酚酸类化合物，为更好地与其他成分分离，流动相一般需增加酸性成分，以避免分离时产生的峰拖尾现象。当归中阿魏酸含量测定时，采用乙腈-0.085%磷酸溶液［9］或者乙腈-0.1%冰醋酸溶液［10］作为流动相，在两种流动相条件下，色谱峰分离度均达不到要求且拖尾峰严重。故增加流动相中磷酸溶液的酸性（0.1%磷酸溶液），流动相为磷酸-乙腈(83∶17)时，色谱峰的分离度和峰对称因子均符合规定。

3.2检测波长选择

2010年版《中国药典(一部)》当归项中阿魏酸含量测定波长采用316 nm［11］。本试验中，在200～400 nm波长范围内扫描阿魏酸对照品溶液，结果阿魏酸对照品在316nm处有最大吸收峰，故选择316nm作为检测波长。

3.3提取溶剂和提取方法选择

阿魏酸在热水、乙醇、甲醇、乙醚、乙酸乙酯中均有较好的溶解性，故供试品溶液中阿魏酸的提取方法可采用直接稀释法或者萃取法［12-13］，其中热水、乙醇、甲醇为稀释剂，乙醚、乙酸乙酯、石油醚为萃取剂。本试验中，比较了6种不同溶剂、两种不同提取方法对阿魏酸提取率的影响。结果采用稀释剂水、乙醇、甲醇的阿魏酸含量分别为0.021 2，0.0209，0.0211 g/L，萃取剂为乙酸乙酯、乙醚、石油醚测得的阿魏酸含量分别为0.020 1，0.011 2，0.001 3 g/L，表明采用直接稀释法测得的阿魏酸含量较高。同时，以水为稀释剂的图谱色谱峰分离度较差，故采用甲醇为稀释溶剂，直接稀释法测定供试品中阿魏酸的含量。

3.4阴性样品选择

本品处方组成中含有当归和川芎，两者皆含有阿魏酸［14］，测定含量时，可同时检测;制备阴性样品时，可制成缺当归、川芎双阴性样品。

3.5阿魏酸含量标准设定

处方中含阿魏酸的以当归、川芎为主，本试验中，以气血宁口服液中阿魏酸含量限度作为制剂质量控制的指标。结果8批样品平均含量为0.019 6 g/L，RSD为0.21%。阿魏酸不稳定，遇到光和热容易分解，其含量相对较低;同时考虑含量限度的制订与药材批次间含量差异，检测允许的误差范围;参照中药含量限度的有关资料［15-16］，阿魏酸含量设定相对较宽，根据实测结果，将含量限度定为1 mL含阿魏酸不得少于8 μg。

［1］潘洪平.八珍汤的药理研究和临床应用［J］.中成药，2003，25（11）：附2-附4.

［2］陈光义，金燕辛，赖水招.八珍口服液的药效学研究［J］.首都医药，1999，6（11）：21-23.

［3］夏泉，张平，李绍平，等.当归的药理作用研究进展［J］.时珍国医国药，2004，15（3）：164-166.

［4］胡益勇，徐晓玉.论川芎解表功效及应用［J］.四川中医，2006，24（6）：41-42.

［5］王振，刘新泳，王静，等.川芎嗪阿魏酸类化合物药理作用的研究进展［J］.齐鲁药事，2011，30（11）：665-667.

［6］欧仕益，包惠燕，蓝志东.阿魏酸及其衍生物的药理作用研究进展［J］.中成药，2001，24（3）：220-221.

［7］陈光义，黄冬，卞益民.八珍口服液的生产工艺及质量控制方法研究［J］.中药材，2003，26（6）：437-443.

［8］林晓春，翁立冬，郑锦坤，等.HPLC法测定气血宁口服液中芍药苷含量［J］.今日药学，2016，26（3）：153-155.

［9］庄志宏，吴剑坤，陈志峰，等.不同产地当归中阿魏酸的含量测定［J］.北京中医药，2011，30（8）：624-625.

［10］朱航.高效液相色谱法测定中药当归中阿魏酸的含量［J］.海峡药学，2006，18（5）：77-78.

［11］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：124-125.

［12］刘俊，宋欣，王满媛，等.不同提取方法测定当归芍药散中芍药苷和阿魏酸含量的比较研究［J］.亚太传统医药，2010，6（3）：20-22.

［13］张晓燕，王金辉，李铣.阿魏酸的化学和药理研究进展［J］.中成药，2006，28（2）：253-255.

［14］刘云华，易进海，黄志芳，等.川芎、当归药材中总阿魏酸的含量测定［J］.中成药，2009，31（11）：1 774-1 776.

［15］李庆德，郑锦坤，李旭桂，等.高效液相色谱法测定醒酒护肝口服液中槲皮素含量［J］.中国药业，2015，24（15）：32-33.

［16］黄罗生，郭健新，刘咏梅，等.HPLC测定阿魏酸含量的探讨［J］.中成药，2004，26（2）：134-136.

Content Determination of Ferulic Acid in Qixuening Oral Liquid by HPLC

Lin Xiaochun1，Weng Lidong2，Zheng Jinkun1，Li Xugui1，Huang Shengchang1，Lin Xiaojia2
（1.Yubei People's Hospital，Shaoguan，Guangdong，China512026；2.Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China510515）

ObjectiveTo establish an HPLC method for the content determination of ferulic acid in Qixuening Oral Liquid.Methods The Kromasil HC-C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）was used，acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（17∶83）was used as the mobile phase，the low rate was 1.0 mL/min and detected at a wavelength of 230 nm，and the temperature was 20℃.Results The content of ferulic acid was linear in the range of 0.02-0.10 μg（r=0.999 9），the average recovery was 99.64%and RSD was 1.04%(n=6).The average results of ferulic acid content were 0.014 4 g/L.ConclusionThis method is simple，quick and accurate，and can be used for the content determination of ferulic acid in Qixuening Oral Liquid.

Qixuening Oral Liquid；HPLC；ferulic acid；content determination

R284.1;R286.0

A

1006-4931（2016）13-0071-03

林晓春(1984-)，男，硕士研究生，药师，研究方向为医院药学，(电子信箱)xiaochunll@ 163.com。

2016-01-20;

2016-03-31）

＊广东省建设中医药强省科研课题，项目编号:20142143;广东医院药学研究基金，项目编号:2015A32;广东省韶关市科学计划，项目编号:2014CX/K204;广东省韶关市医学科研基金，项目编号:Y14064。