老龙皮多糖分离纯化及糖组成研究

张　红，孙婷婷，王海峰，刘建峰

(1.陕西省中医药研究院，陕西西安710003;2.武警工程大学医院，陕西西安710086)

老龙皮多糖分离纯化及糖组成研究

张红1，孙婷婷1，王海峰2，刘建峰1

(1.陕西省中医药研究院，陕西西安710003;2.武警工程大学医院，陕西西安710086)

目的分离纯化老龙皮多糖，并对其糖组成进行测定。方法采用冷水浸提、75%乙醇沉淀、离子交换和凝胶过滤等方法分离纯化老龙皮多糖，采用PMP衍生法及高效液相色谱法测定其糖组成。结果对老龙皮多糖进行了系统分离，得到5个组分，即LKY1，LKY2，LKY3，LKY4，LKY5，并对含量较高的LKY1和LKY2进行进一步分离和糖组成测定。结论初步分离纯化得到5种均一性多糖，并确定其中两种的糖组成，为老龙皮多糖的结构研究提供了一定的研究基础。

老龙皮;多糖;糖组成

老龙皮为子囊地衣类Ascolichenes茶渍目Lecanorales牛皮叶科Stictaceae肺衣属Lobaria Hoffm植物光肺衣Lobaria kurokauae Yoshim.、裂芽肺衣Lobariaisidiosa Vaim.和网肺衣Lobaria retigera Trev.的干燥叶状地衣体，主要生长于岩石表面、树干基部及树皮上，分布于秦岭北坡等地，是陕西部分地区民间常用中药材，具有利水健脾、祛风止痒的功效，临床主要用于治疗小儿疳积、腹胀等，以及水肿、烫伤、无名肿毒、皮肤瘙痒等［1-9］。多糖类化合物是维持生物体正常生理功能所必须的能量来源，同时也是参与生物体中的各类细胞生物活动的活性物质。因此，多糖类药物的活性与结构研究受到越来越多研究者的关注。老龙皮中含有大量多糖［10］，但有关研究报道较少，本课题旨在通过对老龙皮多糖的提取分离纯化及糖组成研究，为老龙皮的开发利用作前期的基础研究工作。

1　仪器与试药

1.1仪器

高速组织捣碎机(上海标准模型厂);T-214型精密电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司);Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司);超低温冷冻干燥器(丹麦);Sorvall RC5C plus型高速低温冷冻离心机(美国Sorvall公司)。

1.2试药

老龙皮采自陕西省宝鸡市红河谷地区。经陕西省中医研究院中药鉴定室杨智峰教授鉴定为肺衣属Lobaria Hoffm植物光肺衣Lobaria kurokauae Yoshim.的干燥叶状地衣体。葡萄糖(批号20140630)、葡萄糖醛酸(批号140648-201403)、甘露糖(批号140651-201403)、阿拉伯糖(批号111506-200001)、半乳糖醛酸(批号111646-200301)、鼠李糖(批号111683-20041)、木糖(批号111508-200404)、半乳糖(批号100226-201105)对照品，均购自中国食品药品检定研究院; PMP(sigma公司，批号101337108);Sephadex G-100 (Pharmacia进口分装产品)。磷酸二氢钠、过氧化氢、冰醋酸、苯酚、硫酸钠、正丁醇、氯化钠、浓硫酸、无水乙醇、氢氧化钠等均为分析纯。

2　方法与结果

2.1老龙皮粗多糖（LKY）的提取［11-12］

将400 g老龙皮于烘箱中50℃烘干，粉碎，加冷水浸提2次，每次12 h，提取液过100目纱布，高速离心机离心，过滤，滤液减压浓缩，加入95%乙醇，使含醇量达75%，静置过夜，过滤，取沉淀反复用75%乙醇清洗2～3遍，蒸馏水溶解，采用Sevage法脱蛋白(THMS∶nbutanol=4∶1)，置振荡器上震荡20 min，离心，取上清液，再加入Sevage试剂适量，重复操作7～8次，至蛋白完全去除后将样品装入透析袋，对水透析2～3 d，取出，冷冻干燥，得到LKY。

2.2老龙皮多糖的分离纯化

2.2.1离子交换柱层析

称取LKY样品1 g，置试管中，加蒸馏水10 mL溶解，离心，取上清液过离子交换层析柱(填料为DEAE-52，50 cm×6 cm)，依次用水和0.05，0.1，0.25，0.5 mol/L NaHCO3溶液洗脱，分部收集流出液。待洗脱完全后，用苯酚-硫酸法在490 nm波长处隔管检测吸光度值，以吸光度值绘制多糖和蛋白的洗脱曲线，并根据洗脱曲线合并各组分，对水透析，减压浓缩，冷干，备用。

2.2.2凝胶过滤柱层析

取上述样品100 mg加蒸馏水2 mL溶解，过G-100凝胶过滤色谱柱进一步分离，以蒸馏水洗脱。

2.2.3分离纯化

取400 g老龙皮药材，粉碎后采用冷水浸提法提取2次，合并提取液，减压浓缩至400 mL，加95%乙醇，使含醇量达75%，静置过夜，过滤。所得沉淀反复用75%乙醇清洗2～3遍，再将沉淀加水100 mL，复溶，Sevage法脱蛋白7～8次，再对流水透析2 d后，取出，冻干，得到黄棕色水提LKY。经采用DEAE-52阴离子交换树脂柱进行分离后得到5个组分:LKY1，LKY2，LKY3，LKY4，LKY5。再取含量较高的LKY1和LKY2，加蒸馏水制成50 g/L的溶液。采用Sephadex G-100凝胶过滤柱(80cm×1.2cm)，流动相为蒸馏水，流速为0.6mL/min，每管4 mL，得到LKY1-A和LKY2-A。洗脱曲线图见图1。

2.3单糖组成测定［13］

2.3.1溶液制备

对照品溶液:精密称取阿拉伯糖2.12 mg，甘露糖2.14 mg，半乳糖醛酸2.27 mg，葡萄糖醛酸1.93 mg，半乳糖1.8 mg，木糖1.87 mg，鼠李糖1.85 mg，葡萄糖1.88 mg，分别置5 mL容量瓶中，用蒸馏水配成2 mmol/L的水溶液，制成单糖对照溶液;将单糖对照品各取800 μL，加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液800 μL及0.3 mol/L NaOH 800 μL，在QT-2旋涡混合器上震荡10 min;70℃水浴中反应40 min，冷却至室温，加入0.3 mol/L HCl 800 μL进行中和，并加入去离子水1 600 μL稀释混匀。用1 mL氯仿萃取3次，静置分层后吸取上层衍生溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

图1　LKY1和LKY2经Sephadex G-100凝胶过滤柱层析的洗脱曲线图

供试品溶液:取样品2 mg，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸在121℃水解2 h，蒸干，加入5 mL氨水溶解。取200 μL与200 μL PMP/甲醇溶液混合，加入200 μL 0.3 mol/L NaOH在QT-2型旋涡混合器上振匀，于70℃水浴锅中加热反应40 min，冷却至室温，再加入200 μL 0.3 mol/L HCl进行中和，加去离子水400 μL，稀释混匀，再用1 mL氯仿萃取3次，静置分层后吸取上层衍生溶液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.3.2色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相:15%乙腈(A)+0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH= 6.9，B)-40%乙腈+0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH= 6.9)，梯度洗脱，见表1;流速:1 mL/min;柱温:25℃。

表1　梯度洗脱条件

2.3.3测定结果

测定结果表明，LKY1-A由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸组成，相对摩尔比为6∶25∶18∶1; LKY2-A由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸组成，相对摩尔比为3∶15∶8∶1。色谱图见图2。

图2　高效液相色谱图

3　讨论

老龙皮中含有大量的蛋白质，蛋白质的存在会干扰糖结构检测结果，因此须将蛋白质去除。Sevage法［14］脱蛋白是采用氯仿、正丁醇等有机溶剂使蛋白转变为变性蛋白，进而分离多糖，操作简便，不破坏多糖结构。多糖粗提取多采用冷水浸提、热水提取、加酸提取、加碱提取等方法，采用冷水浸提不会对多糖结构造成破坏，因此本试验采用热水浸提法提取LKY。

离子交换技术是分离多糖的常用技术，可以有效除去多糖中的蛋白质和色素等，并对多糖进行初步分级，本试验中采用DEAE-52对老龙皮多糖进行初分，得到5个组分:LKY1，LKY2，LKY3，LKY4，LKY5。凝胶过滤技术是分离大分子化合物的常用方法，本试验中采用葡聚糖凝胶G-100层析柱对组分LKY1和LKY2进行细分离，分离效果良好，得到两种均一性多糖LKY1-A和LKY2-A。

PMP作为一种重要的衍生化学试剂，可以在温和条件下(70℃，反应30 min)与糖链的还原端发生反应，并且不会导致糖链脱唾液酸化，且产物无立体异构体，并在245 nm波长处有最强紫外吸收。糖链经PMP衍生后，极性减弱，可用高效液相色谱法检测［15］，因此采用这种方法测定单糖组成。

综上，对老龙皮多糖进行了系统分离，得到5个组分:LKY1，LKY2，LKY3，LKY4，LKY5，并对含量较高的LKY1和LKY2进行进一步分离，确定其糖组成为:LKY1-A由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸组成，相对摩尔比为6∶25∶18∶1;LKY2-A由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸组成，相对摩尔比为3∶15∶8∶1。

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Isolation and Structural Characterization of Polysaccharides from Lobaria Kurokauae Yoshim.

Zhang Hong1，Sun Tingting1，Wang Haifeng2，Liu Jianfeng1
（1.Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine，Xi'an，Shaanxi，China 710003；2.Engineering University of CAPF，Xi'an，Shaanxi，China710086）

ObjectiveTostudytheisolation，purification，monosaccharidecharacterizationofpolysaccharideobtainedfromLobaria kurokauae Yoshim.MethodsThe polysaccharides was extracted from the Lobaria kurokauae Yoshim.with cold water，75%ethanol precipitation and then purified by DEAE-cellulose ion exchange chromatography and Sephadex G-100 gel filtration chromatography；its monosaccharide composition was detected by PMP-derivative method combined with HPLC.ResultsThe crude polysaccharide（LKY）obtained from Lobaria kurokauae Yoshim.was fractionated into 5 sub-fractions by DEAE-cellulose ion exchange chromatography，designated as：LKY1，LKY2，LKY3，LKY4，LKY5.The polysaccharides，termed LKY1-A and LKY2-A was extracted respectively from LKY1 and LKY2 by Sephadex G-100 gel filtration chromatography.Conclusion5 kinds of polysaccharides are obtained by the preliminary isolation and purification，and the monosaccharide of two of them is confirmed，which provides a foundation for the further structural study of Lobaria kurokauae Yoshim.

Lobaria kurokauae Yoshim.；polysaccharides；monosaccharide composition

TQ461;R284.1;R282.71

A

1006-4931（2016）13-0040-04

张红，博士研究生，副主任药师，研究方向为中药质量标准，(电子信箱)zhanghong919919@ 163.com;刘建峰，大学本科，研究员，研究方向为中药质量标准，本文通讯作者，(电子信箱)13032910828@ 126.com。

2016-02-10;

2016-03-16）