甘肃棘豆内生细菌的分析与研究

谢毅鲍锦库

（1.四川大学生命科学学院 四川成都 610000；2.成都蓉生药业有限责任公司 四川成都 610000）

甘肃棘豆内生细菌的分析与研究

谢毅1，2鲍锦库1

（1.四川大学生命科学学院 四川成都 610000；2.成都蓉生药业有限责任公司 四川成都 610000）

甘肃棘豆属于疯草，有毒，为豆科棘豆属多年生草本植物，严重影响我国西南牧区的牲畜安全。植物内生细菌是指定殖在植物组织内部但不引起明显病害症状的细菌，它具有许多生物学功能作用。本文以甘肃棘豆种子为研究对象对其内生细菌进行了分离，并利用形态观察、生化试验等方法进行了初步鉴定。实验共分离到3株菌株，2株杆菌，1株球菌。所得菌株为后续研究甘肃棘豆内生细菌与甘肃棘豆所含毒素的相互关系提供了细菌菌株来源。

棘豆 内生细菌 形态观察 生化鉴定

1 前言

疯草包括棘豆属和黄芪属两类有毒植物，国内外均有广泛分布，甘肃棘豆属于棘豆属疯草中的一种。动物长期或大量采食疯草后，可引起以慢性神经机能障碍为特征的中毒性疾病，称为疯草中毒病，近几年来，疯草的分布迅速蔓延，吞噬优良草地，每年造成700多万只牲畜死亡，已成为影响我国西南牧区危害草原畜牧业可持续发展的主要毒草。

植物内生细菌为植物组织内的正常菌群，是植物微生态系统中的天然组成成分。植物内生细菌长期生活在植物体内的特殊环境中并与宿主协同进化。一方面植物体为其提供生长必需的能量和营养；另一方面，植物内生细菌又可通过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体产生影响。

分析与研究甘肃棘豆内生细菌将对甘肃棘豆毒素（苦马豆素）的产生机理或降解机理的研究有着非常重要的意义，研究初步表明植物内生细菌对产生或降解苦马豆素有一定的作用关系。本研究以甘肃棘豆种子为研究对象对其内生细菌进行了分离，并利用形态观察、生化试验等方法进行了初步鉴定，以期为后续研究甘肃棘豆内生细菌与甘肃棘豆所含毒素的相互关系提供了细菌菌株来源。

2 材料与器材

2.1 材料

甘肃棘豆种子

2.2 试剂与设备

1%次氯酸钠、培养基、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、生化检测管、PBS缓冲液、高压灭菌锅、天平、锥形瓶、表面皿、量筒、培养皿、恒温箱、冰箱、显微镜等。

3 实验方法

3.1 样品预处理

植物组织的内生细菌分离提取的关键是排除植物体表细菌的混杂，以免将外源的细菌定义为植物内生细菌。在内生细菌的分离程序中，表面消毒除去表面细菌而又不杀死植物内生细菌是关键步骤。

经过试验表明，利用蒸馏水漂洗5min后，再使用1%的次氯酸钠溶液消毒10min效果较好，种子冲洗水涂拨在培养基上无细菌生长，种子研磨液涂拨在培养基上又有较多的细菌菌落。

3.2 内生细菌的分离、纯化

甘肃棘豆种子经表面消毒后，用蒸馏水再冲洗一遍，取0.5ml冲洗液加到含有细菌培养基的锥形瓶内，摇床培养3d，作为对照组。

将表明消毒处理后的种子放到经高压除菌消毒的研钵内，加入蒸馏水2ml，研磨，取0.5ml研磨液倒入含有细菌培养基的锥形瓶内，摇床培养3d，作为实验组。

若对照组未有细菌生长，而实验组有细菌生长，则吸取0.1ml培养液涂拨在培养基上培养。

根据菌落形态、颜色和大小统计细菌菌落的种类。挑取不同的菌落，平板划线纯化，纯化后接种到液体培养基培养，取0.5ml培养液甘油保存，放于-20℃冰箱。

3.3 内生细菌的初步鉴定

3.3.1 菌落形态观察

在普通培养基上培养分离的菌株，观察菌落形态（大小、形状、边缘、表面形状、隆起度、颜色及透明度、硬度），必要时可借助于放大镜。

3.3.2 显微镜观察

对分离培养的细菌进行革兰氏染色，光学显微镜下观察细菌形态（革兰氏染色、形状、大小）。

3.3.3 生理生化试验

吲哚、接触酶、VP、酪素水解、淀粉水解、明胶液化、硝酸盐还原、G产酸等实验。

表2 内生菌的生理生化实验结果

4 结果与分析

4.1 菌落形态

GSGD-1的菌落形态：菌落较大、不规则、不整齐、有隆起、表面光滑、灰白不透明、干燥。

GSGD-2的菌落形态：针尖大小、点状、整齐、无隆起、表面光滑、无色半透明、湿润。

GSGD-3的菌落形态：菌落较大、不正圆、不整齐、轻度隆起、表面有皱折、灰白不透明、干燥。

4.2 显微镜观察

GSGD-1形态：杆菌、链状或双、中等大小、两端钝圆，革兰氏阴性。GSGD-2形态：杆菌、单个、体积较大、中间突起两端尖，革兰氏阴性。GSGD-3形态：球菌、单个、中等大小，革兰氏阳性。

4.3 生理生化试验结果

如表2所示。

5 讨论

甘肃棘豆是我国的重要疯草之一，可引起放牧牲畜中毒，严重危害西部地区畜牧业的发展。苦马豆素既是甘肃棘豆的主要毒性成分，又是目前治疗肿瘤的有效药物。但对苦马豆素在甘肃棘豆中的合成机理仍未研究明确。西北农林科技大学的余永涛等已经从毛瓣棘豆、冰川棘豆中分离出可生成苦马豆素的内生真菌。

甘肃棘豆内生细菌与苦马豆素之间存在何种互相作用的关系，内生细菌在甘肃棘豆植物体内能否产生苦马豆素还是能降解该毒素，这些问题的研究将为进一步阐明苦马豆素的合成机理及降解机理提供依据和理论基础，并为从根源上解决动物疯草中毒病和工业化生产生产苦马豆素提供新的研究方向。

本研究论文以甘肃棘豆种子为研究对象，通过表面消毒除去表面微生物的方法，筛选分离到甘肃棘豆种子内生细菌3株，2株革兰氏阴性杆菌，1株革兰氏阳性球菌，为后续甘肃棘豆内生细菌与苦马豆素之间相互作用的机理研究提供了良好的内生细菌菌株资源。

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Analysis and research of endophytic bacteria in Gansu oxytropis

Gansu oxytropis Belonging to crazyweed is toxic， which is perennial herb of oxytropis.It has serious impact on livestock safety of our southwest pastoral areas.Plant endophytic bacteria are designated as bacteria in plant tissues but do not cause obvious symptoms of disease for plant. It has many biological functions.This paper takes Gansu oxytropis seeds as the research object.Endophytic bacteria were isolated from the seeds and the method of morphological observation and biochemical test was used to identify the bacteria.3 strains of bacteria were isolated ， 2 strains of Bacillus， 1 strains of coccus. Research provides a source of bacterial strains for research about the relationship between Gansu oxytropis endophytic bacteria and Gansu Oxytropis toxins.

oxytropis， endophytic bacteria， morphological observation， biochemical identification

Q939

A

1674-2060（2016）02-0001-02

谢毅（1984—），男，汉族，四川成都人，现从事于血液制品行业，就职于成都蓉生药业有限责任公司，具有8年的生产工作经验。同时为四川大学生命科学学院在职研究生。