响应面法优化金针菇液态发酵培养基

黄瑞 伍业旭 李啸

（安琪酵母股份有限公司 湖北宜昌 443000）

响应面法优化金针菇液态发酵培养基

黄瑞 伍业旭 李啸

（安琪酵母股份有限公司 湖北宜昌 443000）

文章运用响应面法优化了金针菇的液体发酵培养基。用Plackett-Burman设计筛选出影响生物量的3个主要因素：玉米粉、葡萄糖和酵母浸粉。在此基础上运用响应面分析法确定主要因子之间的交互作用及最佳条件。

金针菇 响应面法 酵母浸粉

食用菌液态菌种发酵技术是食用菌和工业发酵技术的交叉学科。液体菌种具有培养时间短、发菌快、菌龄整齐、接种方便等优点,利于食用菌规模化、工厂化生产,越来越受到食用菌生产企业的青睐。

安琪酵母浸粉是纯培养的面包酵母经自溶、分离、高温喷雾干燥而成的有机氮源,富含丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素及生长因子等。在食用菌的液体制种阶段能为菌体提供丰富的营养,促进菌体迅速增殖,有效缩短菌体生长周期,降低成本。本文以金针菇为例。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

金针菇：安琪酵母股份有限公司提供；酵母浸粉由安琪酵母股份有限公司提供；XFLS-50MA型灭菌锅 浙江新丰医疗器械有限公司；ZHWY-1102型恒温培养振荡器；上海智城分析仪器制造有限公司SW-CT-1D型净化工作台 苏州净化设备有限公司；AR2140型分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 培养基配置

1.2.1 斜面培养基：PDA培养基。

1.2.2 种子培养基 葡萄糖2%、酵母浸粉0.2%、KH2PO4 0. 15%、MgSO4·7H2O 0.05%、VB150mg/L。

1.2.3 基础发酵培养基玉米粉3%、葡萄糖2%、黄豆粉4%、酵母浸粉0.2%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.05%、VB1 0.005%。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化 在超净台上将菌种接种到已灭菌的斜面培养基上,从斜面取0.5cm2菌块,在恒温23℃条件下培养直到菌丝铺满整个斜面。挑选菌丝洁白、长势好、粗壮、无污染的试管,作为下一步供试菌种。

1.3.2 种子制备 将l00mL液体菌种培养基装入250mL三角瓶, 121℃下灭菌30nin,待冷却至室温后在无菌环境下接入2块约0.5cm2的上述供试菌块,先静置培养24h,然后在25℃,250r/min条件下培养7d。

1.4 实验设计

图1 玉米粉和葡萄糖的交互作用对生物量影响的响应面图（酵母浸粉 0.25%）

图2 玉米粉和酵母浸粉的交互作用对生物量影响的响应面图（葡萄糖2.27%）

图3 葡萄糖和酵母浸粉的交互作用对生物量影响的响应面图（玉米粉4.76%）

表1 Box-Behnken设计各因素与水平

1.4.1 Plackett-Burman设计法筛选影响生物量的显著性影响因素 PB法是一种近饱和的2水平实验设计方法,可以从众多影响因素中快速有效地筛选出最重要的几个因素。本文选用N=7的Plackett-Burman设计表对进行研究,以3组零点值估计误差。

1.4.2 最陡爬坡实验

最陡爬坡法以实验值变化的梯度方向为爬坡方向,根据各因素效应值的大小确定变化步长,能快速逼近最佳值区域。根据实验1.4. 1的结果,做最陡爬坡实验。

1.4.3 Box-Behnken设计 以爬坡设计得出的实验结果为依据进行Box-Behnken设计,用软件Design expert 7.0对实验进行回归分析并求得最优值,得出响应面分析结果,进而确定最佳培养条件,最后依据回归方程绘制响应面立体分析图。

1.4.4 验证 用所得到的结果进行5次平行实验,取平均值以验证模型的可靠性。

表2 Plackett- Burman设计回归分析

表3 最陡爬坡实验结果

表4 Box-Behnken设计回归分析

2 结果与讨论

2.1 Plackett-Burman实验设计结果分析

此模型R2为0.9227,说明 92.27%的数据可用该模型解释。模型P值为0.0057＜0.05,即模型极显著,可在0.01水平上拟合数据。失拟项P值为0.0673＞0.05,表明失拟项不显著,模型没有出现失拟的现象。从表中各影响因素的P值可以看出,对金针菇生物量影响最显著的3个因素依次为：A＞B＞D,即玉米粉＞葡萄糖＞酵母浸粉。

2.2 最陡爬坡实验

根据表2中A、B、D 3个因子估计系数的正负,依次增大或减小,玉米粉和酵母浸粉是正效应,应依次增大；葡萄糖是负效应,应依次减小；其他非显著性因素根据表4中的估计系数的正负分别取Plackett-Burman设计中的最大值或最小值。爬坡实验结果见表3。

结果表明,随着三个组分的变化,生物量呈现先增大后减小的变化。当玉米粉为4%,葡萄糖为2%,酵母浸粉为0.3%时,金针菇生物量最大。因此,后续响应面实验以实验号2各因素水平为中心值来进一步设计优化。

2.3 Box-Behnken设计结果与分析

模型相关性系数R2为0.9317,说明93.17%的变异能由该模型解释；模型P值为 0.0191表明模型是极显著的,失拟项P值为0.1775表明模型没有产生失拟现象。A（玉米粉）,B（葡萄糖）对金针菇生物量的影响是极显著的,D（酵母浸粉）其次；AB的交互影响是显著的,AD, BD的交互影响不显著。

通过二次模型回归系数的计算,得到如下方程以表征3个因素对生物量的影响：

R=-914.19125+291.40167A+588.21083B+3247.81250D+91. 40500AB -299.82500AD-2.90000BD-44.47833A2-224.88333B2-3592.08333D2。

式中,R代表金针菇生物量（mg/100mL）,A、B、D分别代表玉米粉、葡萄糖和酵母浸粉的实际质量百分数。利用Design expert7.0解得得最优值点为A=4.76,B=2.27,D=0.25,即质量浓度分别为乳糖4.76%,玉米浆2.27%,酵母浸粉0.25%,预测最大生物量为858. 231mg/100mL。根据上述拟合回归方程作响应面分析图。

2.4 验证实验

用上述步骤得出的最佳培养基配方：玉米粉4.76%,葡萄糖2. 27%,酵母浸粉0.25%,黄豆粉 3%,KH2PO40.25%,MgSO4·7H2O 0.07%,VB1 0.003%,做5组平行实验,结果显示实验值（849.528± 4.390）U/mL与预测值接近,表明模型合理,数据可由此模型解释。

3 结论

本研究优化筛选出3个显著性影响因素：玉米粉、葡萄糖和酵母浸粉,确定了最佳培养基组合：玉米粉4.76%,葡萄糖2.27%,酵母浸粉0.25%,黄豆粉 3%,KH2PO40.25%,MgSO4·7H2O 0.07%,VB10.003%。在该最佳培养基组合下,金针菇实际生物量达到849. 528mg/100ml,与理论预测最大生物量接近,说明响应面法优化金针菇液体发酵培养基是合理的。生物量相比优化前提高了17.43%。

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TS2

A

1674-2060（2016）03-0087-02