不同营养条件下维罗纳气单胞菌菌毛表达与生物膜形成能力的比较

夏金成 阙彤彤 张文君 赵聪 杨秦

（邵阳医学高等专科学校 湖南邵阳 422000）

不同营养条件下维罗纳气单胞菌菌毛表达与生物膜形成能力的比较

夏金成 阙彤彤 张文君 赵聪 杨秦*

（邵阳医学高等专科学校 湖南邵阳 422000）

目的：检测不同培养基条件下（即不同营养条件下）维罗纳气单胞菌菌毛动力和生物膜生成能力（即致病能力）。方法：半固体培养基穿刺阳培养检测细菌动力，喉上皮细胞粘附实验检测生物膜形成能力，最后统计分析差异性。结果：BHIB培养基比LBA培养基中，野生型都比菌毛缺失的MSHB突变维罗纳气单胞菌有更高的动力和生物膜形成能力，但之间都无显著差异（P＜0.05）。结论：不同培养基基条件对菌毛动力有影响，而菌毛表达对生物膜致病性有一定关系。

维罗纳气单胞 菌毛 半固体穿刺 粘附

生物膜多细胞结构的形成是一个复杂且高度规律的动态过程,包括细菌起始黏附、生物膜黏附期、生长期、成熟和播散期等阶段［1］。首先, 游动细胞接受环境中的营养信号, 通过鞭毛或菌毛等附着结构黏附于表面； 附着于表面后的细菌不断繁殖并吸引其他细菌继续附着, 使该附着位点细菌呈高密度状态从而产生抗生素抵抗性［2］。鞭毛、菌毛介导的动力性和黏附性在细菌致病性中发挥重要作用, 其与细菌的生物膜形成、耐药性和慢性感染中的相关性日益受到医学界的重视［3］。本次实验通过检测不同培养基条件下（即高低营养差别条件下）维罗纳菌菌毛对动力和有机体细胞粘附的作用,探讨细菌菌毛对生物膜形成的起始黏附、生物膜黏附期的意义。为抗菌,制药做出基础贡献。

1 材料和方法

1.1 菌种

本次采用的是两种维罗纳气单胞菌：MSHB+（野生型有菌毛）和MSHB-（基因突变型无菌毛）。这两种细菌均来源以前研究工作的保种。它们有鞭毛表达,只在菌毛表达上有差异。

1.2 细菌培养基和生长条件

BHIB和LBA培养基分别是相对高和相对低营养状态的培养基。维罗纳气单胞菌被分别放在不同培养基中37℃培养,等到细菌长到对数生长期后,用于接下来的半固体培养基穿刺和生物膜形成能力实验。

1.2 免疫印迹

1.2.1 细菌菌毛蛋白的收集

首先将两种培养细菌用PBS洗涤三次,再将每种细菌悬浮在1mlPBS溶液中。把此PBS溶液吸入皮下注射器,并对着eppendorf管壁反复挤出和吸入。最后在13200转/分钟,室温条件下离心25分钟,以分离细菌和菌毛蛋白。紧接着加入缓冲溶液,煮沸变性。最后再离心一分钟,把上层溶液用于跑胶。

1.2.2 SDS-PAGE电泳

按照普通的8%的胶的方法配制凝胶,跑胶。

1.3 半固体培养基穿刺培养实验

1.3.1 半固体培养基配制

琼脂4g/l,牛肉膏粉末3 g/l,蛋白胨5g/l,氯化钠5 g/l,调节pH=7.4。混匀溶解后,以3厘米为高度分装于玻璃试管中。将分装后的玻璃试管用锡箔纸包住封口。高温高压灭菌,放凉。

1.3.2 细菌接种

在超净工作台中,用接种针将不同的细菌分别接种在灭菌后的半固体培养基中。穿刺深度以试管中琼脂高度的1/2-3/4为宜。穿刺轨迹你应循原路退出,刺入及拔出时要接种针不向穿刺线外摆动。穿刺后封口,37℃培养,72小时观察结果。如有细菌沿着穿刺线扩散,那么细菌就有动力。每种菌株重复50次。

1.4 喉上皮细胞粘附实验（生物膜形成能力检测）

将两种不同细菌接种在两种不同培养基中。喉上皮细胞粘附实验的方法与之前报道的方法一致［4］。

1.5 SPSS统计分析。

使用SPSS19.0软件进行相关统计分析。

2 结果

结果表明野生型（MSHB+）有菌毛而突变型（MSHB-）没有。βactin是内参。

表1 半固体培养基穿刺实验

图1 菌毛蛋白表达的免疫印迹

图2 喉上皮细胞粘附实验

结果表明野生型（MSHB+）比突变型（MSHB-）维罗纳气单胞菌有更强动力,但之间并无显著区别（p＜0.05）。

结果表明在两种不同培养基中（相对高营养的BHIB和相对低营养的LBA）,野生型（MSHB+）比突变型（MSHB-）维罗纳气单胞菌都具有更强粘附能力,但无论哪一种之间并无显著区别（p＜0.05）。

3 讨论

生物膜是细菌在表面生活时采取的一种生长方式, 它是细菌的一种本能, 尤其适合细菌在不利环境中生存,对细菌产生保护作用； 生物膜最重要的特性是对抗生素的高度耐药性［5］,它能够有效地阻挡药物作用于膜内的细菌。生物膜与临床中、西药耐药性是目前研究的热点。本次实验结果（表1）证明,有菌毛表达的维罗纳气单胞菌有更强的动力,而更强动力的细菌更能粘附宿主细胞（图2）。基于菌毛、粘附和生物膜形成之间的关系。通过本次研究,我们揭示了维罗纳菌菌毛部分的致病能力,为药物开发等研究奠定一定基础。

［1］Butler M T，Wang Q，Harshey R M.Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.J Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（8）：3776-81.

［2］Merino S，Shaw J G，Tomas J M.Bacterial lateral flagella： an inducible flagella system.J FEMS Microbiol Lett， 2006， 263（2）：127-35.

［3］ Giron J A，Levine M M，Kaper J B.Longus： a long pilus ultrastructure produced by human enterotoxigenic Escherichia coli.J Mol Microbiol，1994，12（1）：71-82.

［4］Thornley，J.P.，Shaw，J.G.，Gryllos，I.A.& Eley，A. （1997）Virulence properties of clinically significant Aeromonas species：evidence for pathogenicity.Review in Medical Microbiology，8，61-72.

［5］Van Houdt R，Michiels C W.Role of bacterial cell surface structures in Escherichia coli biofilm formation.J Res Microbiol，2005，156（5-6）：626-33.

Q2

A

1674-2060（2016）03-0005-01

课题来源： 2015年度湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（653）；2015年度湖南省教育厅科研项目（15C1255）。

夏金成， 阙彤彤， 张文君， 赵聪，邵阳医学高等专科学校2014级检验专业学生。

杨秦（1981—），男，讲师，主要研究方向为生物化学与分子生物学。