异源表达酮还原酶的重组菌单羰基还原1,2-环己二酮*

李尧益，李凌凌，吕早生，左振宇

(武汉科技大学化学与化工学院，湖北　武汉　430081)



异源表达酮还原酶的重组菌单羰基还原1,2-环己二酮*

李尧益，李凌凌，吕早生，左振宇

(武汉科技大学化学与化工学院，湖北武汉430081)

利用表达糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶的重组大肠杆菌细胞EscherichiacoliBL21 (pET-eryKR1)2对1,2-环己二酮进行了催化还原反应，该还原反应为单羰基还原而非双羰基还原，生成的产物为2-羟基环己酮。对重组细胞催化1,2-环己二酮还原的反应条件进行了优化，发现最优的反应条件为底物浓度20 mmol/L，细胞密度80 g/L，pH 6.0，转速120 r/min，温度37 ℃，且需要添加10 g/LE.coliBL21 (pET-gdh1)辅酶再生系统和0.2 mmol/L NADPH。在该反应条件下，重组菌催化反应10 h后，底物的转化率可高达84.2%。

酮还原酶；聚酮合成酶；生物催化；1,2-环己二酮；2-羟基环己酮

从潜手性羰基化合物出发，以生物催化的方式不对称还原合成手性药物中间体手性醇，具有反应温和、绿色环保、成本较低和光学选择性较高等特点，是手性醇合成方法中的一个重要组成部分。

含有环己基的手性醇是很多医药、农药、有机化工产品及材料的重要中间体[1-2]，通过生物催化方法选择性还原取代环己酮合成这类手性醇的报道较少[3]。有些学者尝试利用多种植物，如胡萝卜、土豆、苹果、黄瓜、洋葱等，立体选择性地催化1,2环己二酮还原，其生成的还原产物均为1,2-环己二醇，即底物中的双羰基都被选择性地还原[3]。目前还没有有关生物催化1,2环己二酮的单羰基还原的报道。

酮还原酶(ketoreductase，KR)是合成红霉素大环内酯环的聚酮合成酶(polyketide synthase，PKS)中负责催化每轮碳链还原的酶域[4-5]。2006年Bali等[6]报道了聚酮合成酶的酮还原酶能够催化如环己酮、2-甲基环己酮、2-烯丙基环己酮、1,2-环己二酮及二环己基甲酮等含环己基结构的底物的还原，但该研究没有得出有关还原产物的结构、反应的转化率、产率和光学选择性的数据。2011年，Piasecki[7]等利用多种聚酮合成酶的酮还原酶针对若干α-替代的β-羰基双酮中间体进行立体选择性还原，结果显示了聚酮合成酶的酮还原酶具有成为工业生产各种各样手性砌块的生物催化剂的巨大潜力。2010年，笔者发现表达糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶(eryKR1)的重组大肠杆菌EscherichiacoliBL21 (pET-eryKR1)2，能催化环己酮的还原，产物环己醇的产率高达93.24%，且该重组菌还可以不对称还原2-甲基环己酮，生成顺式-2-甲基环己醇，产率为41.87%，ee值为74.81%[8]。为进一步考察重组菌E.coliBL21 (pET-eryKR1)2可否成为催化1,2-环己二酮还原的生物催化剂，研究了重组菌催化还原1,2-环己二酮的产物的结构，并通过优化转化反应条件，来提高反应的转化率。

1　实　验

1.1实验材料及仪器

1.1.1菌种和质粒

重组大肠杆菌E.coliBL21(pET-eryKR1)2[8]及E.coliBL21(pET-gdh1)(表达枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶的重组菌)[9]于本实验室构建保藏。

1.1.2培养基

LB培养基(%)：用于培养大肠杆菌，Tryptone 1.0 g，Yeast Extract 0.5 g，NaCl 1.0 g，pH=7.0[10]。

1.1.3化学试剂

1,2-环己二酮(98%)，购自Alfa Aesar；2-羟基环己醇，购自Aldrich。

1.1.4主要仪器

气相色谱仪Agilent HP6890，气相色谱质谱联用仪(GC/MS) HP6890/5973。

1.2方法

1.2.1重组菌的培养及酶的诱导表达

重组菌以5%的接种量接种到含有100 μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中，37 ℃、150 rpm培养3 h，菌液吸光值(A600)大约达到1.0时，加入1 mmol/L IPTG，再在37 ℃下诱导表达4 h后，离心收集菌体(4000 r/min，4℃，10 min)，并用0.1 mol/L的磷酸钾缓冲液(pH 6.0)悬浮洗涤几次后，从而获得用于转化反应的菌体[9]。

1.2.2重组菌催化还原环己二酮的转化反应

还原1,2-环己二酮的转化反应体系：40 g/LE.coliBL21(pET-eryKR1)2湿菌体(菌体的干湿比大约0.25)，10 g/LE.coliBL21(pET-gdh1)湿菌体(干湿比同上)，0.1 mol/L葡萄糖，0.2 mmol/L NADPH，60 mmol/L 1,2-环己二酮，0.1 mol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.0)[11]。

在37 ℃、200 r/min的摇床中，反应液振荡反应6～12 h后，离心收集上清(6000 r/min，10 min)。考察单一因素对还原反应转化率的影响时，只需改变一般体系中被考察因素的量即可。

1.2.3还原产物的分析

2　结果与讨论

2.1重组菌催化还原1,2-环己二酮的产物分析

利用气相色谱质谱联用分析重组细胞催化还原1,2-环己二酮的转化液(结果见图1)，结果显示转化液(气相色谱结果见图1a)中主要由出峰时间在8.204 min的底物1,2-环己二酮和出峰时间在8.001 min的还原产物2-羟基环己酮(该物质的质谱分析结果见图1b)组成，这说明重组细胞不能同时还原1,2-环己二酮的两个羰基，只能选择单个羰基还原，推测可能是由于邻位的两个羰基之间形成的空间位阻，造成酶很难同时还原两个羰基，或者可能是由重组细胞中表达的酶催化反应的特异性决定，该酶只能催化还原单个羰基。

图1　重组细胞还原1,2-环己二酮转化液的气相色谱质谱联用分析Fig.1　GC-MS analysis of transformation ferment of 1,2-cyclohexanedione by recombinant cells

2.2重组菌催化1,2-环己二酮单羰基还原反应的条件优化

2.2.1E.coliBL21(pET-gdh1)及NADPH的添加对1,2-环己二酮的单羰基还原反应的影响

NADPH和E.coliBL21(pET-gdh1)的添加对E.coliBL21(pET-eryKR1)2以1,2-环己酮为底物进行的还原反应的影响结果如表1所示：仅添加NADPH的情况下，由于大肠杆菌中合成及再生NADPH的能力较低[12]，只能一次性满足还原反应的需要，因此，1,2-环己二酮的转化率较低，仅为7.95%；而在只添加辅酶再生系统E.coliBL21(pET-gdh1)的条件下，葡萄糖脱氢酶可以利用大肠杆菌自身合成的少量NADPH完成辅酶再生，因此，转化率可提高至21.73%；若同时添加NADPH和E.coliBL21(pET-gdh1)辅酶再生系统，可从根本上解决还原态辅酶NADPH的再生问题，转化率会高达29.24%[9]。

表1　辅酶再生系统对E.coli BL21(pET-eryKR1)2催化1,2- 环己二酮还原反应的影响Table 1　Effect of coenzyme regeneration system on the reduction of 1,2-cyclohexanedione by recombinant strain

反应条件：底物浓度为60 mM，细胞密度40 g/L，pH 6.0，温度37 ℃，转速200 r/min，反应6 h。

2.2.2底物的初始浓度对1,2-环己二酮的单羰基还原反应的影响

底物的浓度会影响底物和酶的结合，从而影响生物转化反应的效率。在反应体系中，加入不同浓度的底物，来考察底物的初始浓度对催化还原1,2-环己二酮的反应的影响(见图2)。从图中可以看出，当底物的初始浓度达到20 mmol/L后，随着底物浓度的增大，底物的转化率会明显地下降，这是由于高浓度的底物会对酶活性产生抑制作用[12-15]。当1,2-环己二酮的浓度为20 mmol/L时，转化率最高，可以达到49.15%。

图2　底物浓度对重组菌催化1,2-环己二酮还原反应的影响Fig.2　Effect of substrate concentration on the reduction of 1,2-cyclohexanedione by recombinant strain

2.2.3细胞密度对1,2-环己二酮的单羰基还原反应的影响

反应体系中的菌体量决定了参与催化反应的酶量，从而影响了生物转化反应的转化率。研究加入不同菌体量的反应体系中，重组细胞催化1,2-环己二酮还原反应的转化率的变化趋势(见图3)。从图中可看出，在底物浓度为60 mmol/L的反应体系中，比起低细胞密度的重组细胞(20 g/L和40 g/L)，高细胞密度的重组细胞(80 g/L)催化反应的转化率，会提高了2～5倍。当反应10 h后，最高的转化率可达到75.2%。这说明在此还原反应中，高浓度底物对酶活性的抑制作用，可以通过接种入高细胞密度的重组细胞来解除。

图3　细胞密度对重组细胞催化1,2-环己二酮还原反应的影响Fig.3　Effect of cell density on the reduction of 1,2-cyclohexanedione by recombinant strain

2.2.4pH对1,2-环己二酮的单羰基还原反应的影响

反应体系中的pH可以通过影响酶的稳定性，来影响催化反应，过高或过低的pH值均可以使酶蛋白的空间结构破坏，进而影响酶的立体选择性和催化活性。为考察反应体系中的pH值对重组细胞催化1,2-环己二酮还原反应的影响，研究分析了重组细胞在不同pH值的磷酸钾缓冲体系中，催化1,2-环己二酮还原的转化率，结果如图4所示，pH对反应的转化率影响较大，当转化反应的pH<5和pH>7时，反应的转化率会随着pH的升高和降低，而显著降低。当pH值为6的时候，反应的转化率最大，可达到了71.21%，说明重组细胞中的酶对体系pH的要求较高，其发挥催化活性的最适pH为6.0。

图4　pH对重组菌催化1,2-环己二酮还原反应的影响Fig.4　Effect of pH on the reduction of 1,2-cyclohexanedione by recombinant strain

2.2.5温度对1,2-环己二酮的单羰基还原反应的影响

比较25 ℃、30 ℃和37 ℃条件下，重组细胞还原1,2-环己二酮的转化反应(见图5)，从图中可以看出，温度对反应转化率有着较大的影响，37 ℃下的反应转化率比25 ℃的提高了近3倍，说明在本实验所考查的温度范围内，反应温度的相对提高，可以促进酶的活性，进而提高反应的转化率，而且随着反应时间的延长，转化率也会随着升高。

图5　反应温度对重组细胞催化1,2-环己二酮还原反应的影响Fig.5　Effect of reaction temperature on the reduction of 1,2-cyclohexanedione by recombinant strain

2.2.6转速对1,2-环己二酮的单羰基还原反应的影响

为了考察氧的传递对重组细胞催化1,2-环己二酮还原反应的影响，比较不同转速下的反应转化率的变化情况，结果如图6所示，相较于静置，振荡不仅可以使得重组细胞获得充足的氧气来生长代谢，发挥其催化性能，而且菌体与底物的接触更加充分，进而反应的转化率提高，且共加入的E.coliBL21(pET-gdh1)中表达的葡萄糖脱氢酶催化辅酶再生的反应，也需要有充足的氧气参与。但是，在转速过高的情况下，产生的强大的剪切力会对细菌的损害过大，这时，转化率会有所下降。因此，在所考察的转速条件下，选用120 r/min作为最适合转化反应的振荡速度。

图6　转速对重组菌催化1,2-环己二酮还原反应的影响Fig.6　Effect of rotation speed on the reduction of 1,2-cyclohexanedione by recombinant strain

2.2.7验证试验

根据上述的研究，可以确定重组菌还原1,2-环己二酮生成2-羟基环己酮的最佳工艺条件为：底物浓度为20 mmol/L，细胞密度为80 g/L，pH值为6.0，温度为37 ℃，转速为120 r/min，且需要同时添加一定量的E.coliBL21(pET-gdh1)和NADPH来解决辅酶再生问题。于是，在最佳的转化反应条件下，进行了验证试验，结果显示在添加了0.2 mmol/L NADPH以及10 g/L的E.coliBL21(pET-gdh1)的pH 6.0的反应体系中，80 g/L重组细胞与20 mmol/L的底物1,2-环己二酮，在温度为37 ℃、振荡速度为120 r/min的条件下反应10 h后，转化率可以高达84.2%(转化液的气相色谱检测结果见图7)。

图7　重组菌还原1,2-环己二酮的转化液的气相色谱检测结果Fig.7　Gas chromatography analysis of transformation ferment of 1,2-cyclohexanedione catalyzed by recombinant strain

3　结　论

本研究分析了表达eryKR1的重组大肠杆菌对1,2-环己二酮的还原能力，结果显示该重组菌能还原1,2-环己二酮上的单个羰基，生成2-羟基环己酮。该研究结果不仅证实了Bali等提出的eryKR1酶域能够较好地催化含环己基结构的底物的还原的结论，而且第一次得出了该还原反应的产物是由底物的单羰基还原而生成的2-羟基环己酮。然而目前报道的生物催化还原1,2-环己二酮，主要是立体选择性还原其上的双羰基，产生1,2-环己二醇[3]。已知在化学反应中，选择性单羰基或硝基的还原反应可以采用转移氢化反应来实现，如1,3-二硝基苯、4-氯-1,3-二硝基苯、4-甲基-1,3-二硝基苯等含多个硝基的化合物，可以在以一种含镍的六角形金属多孔磷酸铝分子筛为催化剂，2-丙醇为氢供体的条件下，立体选择性地进行单硝基的还原[16]。但是，由于利用转移氢化反应进行选择性单羰基还原，所使用的催化剂相对比较昂贵，所以，生物催化方法，无疑为选择性单羰基还原，提供了一种成本低廉的解决方案。

另外，本研究确定了重组菌还原1,2-环己二酮生成2-羟基环己酮的最佳工艺条件为：底物浓度为20 mmol/L，细胞密度为80 g/L，pH值为6.0，转速为120 r/min，温度为37 ℃，且需要同时添加一定量的E.coliBL21(pET-gdh1)和NADPH解决辅酶再生问题。在此最佳转化反应条件下，重组菌反应10 h后，转化率可以高达84.2%。

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Single Carbonyl Reduction of 1,2-cyclohexanedione Catalyzed by Recombinant Strain Heterologously Expressing Ketoreductase*

LIYao-yi,LILing-ling,LVZao-sheng,ZUOZhen-yu

(School of Chemistry and Chemical Engineering, Wuhan University of Science and Technology, Hubei Wuhan 430081, China)

Recombinant strainEscherichiacoliBL21(pET-eryKR1)2, which heterologously expressed ketoreductase in the first module of polyketide synthase from Saccharopolyspora erythraea, fermented with 1,2-cyclohexanedione as reduction substrate. In that reaction, the reduced product of substrate was 2-hydroxycyclohexanone, its single carbonyl was reduced. The conditions with substrate concentration of 20 mmol/L, cell density of 80 g/L, pH of 6.0, rotation speed of 120 r/min and reaction temperature of 37 ℃ were optimal for this biocatalytic conversion with the addition of 10 g/L of coenzyme regeneration systemE.coliBL21(pET-gdh1) and 0.2 mmol/L of NADPH. The conversion rate of 1,2-cyclohexanedione catalyzed by the recombinant cells for 10 h could reach 84.2% under these conditions.

ketoreductase; polyketide synthase; biocatalysis; 1,2-cyclohexanedione; 2-hydroxycyclohexanone

湖北省科技厅基金项目(编号：2009CDA006)，国家级创新创业训练计划项目(编号：201410488011)。

李凌凌(1981-)，女，武汉科技大学，博士，副教授，主要从事生物浸矿和生物催化。

Q789, Q815

A

1001-9677(2016)018-0062-05