脑红蛋白对神经保护作用的研究

李 直，李依芃，邓锦波

河南大学 生命科学学院，河南 开封 475004



脑红蛋白对神经保护作用的研究

河南大学 生命科学学院，河南 开封 475004

脑红蛋白(neuroglobin，NGB)是一种六配位血红素单体球蛋白，被发现在机体的神经系统以及其他器官与组织中均会有不同程度的表达。在体外培养的神经细胞中以及实验动物的神经系统内，脑红蛋白的升高可以减少神经元受到的损伤。研究表明，脑红蛋白是一种内源性神经保护分子，脑红蛋白的超表达在清除活性氧物质、减轻一氧化氮引起的损伤、减少神经退行性疾病的发病、创伤性脑损伤的保护等中的作用更为显著。然而，其神经保护作用的机制尚不完全明确。本文对脑红蛋白的结构、分布、神经保护作用以及可能的机制做一简单介绍。

脑红蛋白；六配位结构；神经保护

血红蛋白(hemoglobin，HB)和肌红蛋白(myoglobin，MB)曾经被认为是脊椎动物的仅有的球蛋白类型。HB通常存在于脊椎动物的红细胞中，由两个相同的α链和β链组成，具有运输氧的功能，可以从肺部运送氧到组织；MB主要存在于肌肉中，是由一条蛋白链以及一个血红素辅基组成的，主要在肌肉内运输和储存氧的单体蛋白。2000年，一种新的球蛋白被首次发现于哺乳动物的大脑，因而被称为脑红蛋白(neuroglobin， NGB)[1]。由于体内的球蛋白已经被发现可以作为氧气的运输、储存蛋白以及氧传感器等功能，所以与氧有着高亲和力的NGB被推测在常氧或者缺氧条件下的生理及病理过程中可能发挥重要作用。

1　脑红蛋白的结构、分布

图1　六配位球蛋白与五配位球蛋白之间的平衡左侧是远端HisE7占据第六个配位的双组氨酸六配位结构，如NGB结构；中间是未被占位的五配位结构，如HB或者MB的结构；右边是与外源性配体O2与远端HisE7竞争性绑定第六个配位键的六配位结构。(Biochim Biophys Acta， 2015， 1850： 169-177)

1.1脑红蛋白结构

球蛋白可以分为五配位结构与六配位结构两种。有一个组氨酸侧链配体附着的含铁血红素蛋白分子被称为五配位球蛋白，以红细胞中的血红蛋白和其他大多数氧转运蛋白为代表；有两个组氨酸侧链配体附着的含铁血红素蛋白分子被称为六配位球蛋白，动物体内的脑红蛋白、在高浓度有机溶剂或者低pH值情况下应激转化的人类血红蛋白，以及植物体内的非共生植物血红蛋白(nonsymbiotic hemoglobins)等是六配位球蛋白[2]。MB是具有代表性的五配位结构球蛋白：铁被卟啉环上的四个氮原子与在肽链中第8位的近端组氨酸F螺旋上的一个氮原子(proximal histidine in the F helix，HisF8)绑定，形成五配位结构。NGB是具有代表性的六配位结构球蛋白。生理条件下，肽链会盘绕成球形，把血红素分子紧密的包裹在里面，从而形成经典的螺旋三明治夹心样的球状折叠结构。铁在与轴两极等距的中纬线上与卟啉环上的四个氮原子和轴向上稳定保守的近端HisF8协调配位。在缺少外源性结合配体的情况下，轴向上另一远端位点被内源性残留的配体通常是肽链中第7位的远端组氨酸E螺旋上的一个氮原子(the distal histidine in the E helix，HisE7)占位，从而形成双组氨酸六配位结构。通过X射线晶体学和光谱学的检测也显示出，NGB是一种远端HisE7占第6配位的双组氨酸球蛋白[3]。因此，NGB与外源性配体如O2、CO、NO等发生结合时，首先要打破铁和远端HisE7之间的纽带，而后外源性配体才有可能与NGB结合。外源性配体与内源性远端HisE7之间的竞争导致了配体结合动力学的复杂模式[4](图1)。由于六配位球蛋白的远端HisE7相对容易发生结构上的可逆改变，球蛋白在五配位的构象上可以降低活性以保持相对稳定，更好的应对机体所需要的氧的运输等生物功能，因此所有动物的六配位球蛋白都可能是五配位球蛋白结构的原始祖先状态进化演变而来[2]。

1.2脑红蛋白的分布

NGB是一个具有150个氨基酸残基的单体蛋白质，主要分布在中枢和外周神经系统。应用免疫印迹法在人类神经干细胞中已检测到有NGB的表达，从神经干细胞到神经细胞的进一步分化都伴随着NGB表达的不断增加[5]。在鱼类、两栖类和鸟类的大脑中NGB也有表达，因此,NGB可能存在于所有的脊椎动物的神经系统[6]。高雪晋等[7]用免疫组织化学染色法，研究了NGB在西门塔尔牛中的分布。结果显示：NGB在西门塔尔牛的神经系统以及心脏、睾丸、子宫等多种组织细胞中均有分布。NGB虽然在机体中分布广泛，但是其免疫组化染色显示的阳性表达却有明显的强度差异，脑红蛋白表达的浓度变化取决于组织对氧的需求量[6]。NGB优先驻留代谢活跃的细胞和亚细胞间隔，低氧分压区通常没有或较少存在NGB。此外，NGB浓度还与线粒体的分布密切相关，约有百分之十的NGB分布在线粒体中。这一观察结果为NGB和氧化代谢之间的关联提供了强有力的证据[1]。大量研究表明，NGB已经在脑肿瘤和非脑肿瘤中被检测到。NGB 的mRNA和蛋白在大脑肿瘤细胞系中表达的有：大鼠星形细胞瘤，人脑星形细胞瘤；在非脑组织肿瘤细胞中表达的包括：非小细胞肺癌细胞，小细胞肺癌细胞和人肝癌细胞等[8]。免疫组织化学染色显示肿瘤组织NGB表达高于相应的正常组织[9]。

2　脑红蛋白的神经保护作用与可能机制

2.1脑红蛋白与脑缺血缺氧

在生理条件下，内源性NGB是减轻缺血缺氧引起的脑损伤的神经保护剂。研究表明，通过采用大鼠全脑缺血模型对海马CA1区观察发现，肢体缺血预处理(Limb ischemic preconditioning， LIP)使NGB表达明显上调，保护神经元免受缺血再灌注损伤,而在肢体缺血预处理(LIP)和大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion， MCAO)后， NGB阳性细胞的数量均在海马、皮质和下丘脑随着再灌注时间增长而增加。缺血预处理后NGB可减轻缺血和缺氧介导的脑损伤[10]。在小鼠大脑发育早期(Postnatal 0)，急性缺氧暴露使NGB表达上调。表明脑红蛋白在小鼠大脑成熟过程中的早期阶段参与未成熟的神经元对于急性缺氧适应的反应[11]。在双侧颈总动脉闭塞的情况下，NGB阳性神经元数在大脑皮层增加而在海马降低。这可能是由于不同的小鼠品系以及小鼠大脑皮质和海马的神经元对于缺血缺氧的反应不同。NGB在大脑海马相比于大脑皮质中对缺血缺氧的响应可能会更快，持续时间可能更短[8]。长时间慢性缺血缺氧可能通过NGB自氧化和泛素化促进NGB的降解，因此长期慢性的缺血缺氧NGB表达不上调[12]。NGB在脑缺血缺氧中的表达比较复杂，取决于多种因素。缺血缺氧诱导的NGB可能的调控机制：缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是一种应对缺氧反应的转录因子。NGB的mRNA与HIF-1α依赖的靶基因在新生小鼠急性缺氧后均显著上调，表明HIF-1α可能在缺血缺氧过程中参与NGB表达调控。HIF-1α可以被脯氨酰羟化酶(PDH)羟基化，在缺乏氧气时 PHD活性会随着与其呈负相关的IKB激酶-β的激活而被抑制，导致HIF-1α积累和激活下游转录。在特异性蛋白(SP1)的启动子上，HIF-1α可以与其相应位点结合，刺激SP1在大鼠脑缺血缺氧后迅速转录。研究发现，大鼠NGB基因核心近端启动子554 bp片段可能含有NF-κB(核因子-κB)、CREB(cAMP反应元件结合蛋白质)和EGR1(早期生长反应因子1)的结合位点。超表达与敲除这些转录因子，分别增加和减少NGB表达。这表明NF-κB、CREB和EGR1通过与小鼠脑红蛋白基因的启动子的特异性相互作用可以直接调节NGB表达。缺氧也可能通过其他机制如诱导促红细胞生成素(EPO)和血管内皮生长因子(VEGF)等来诱导NGB表达上调。另外，NGB启动子的甲基化也可能是一个NGB表达于神经元或大脑的调节机制[8]。

2.2脑红蛋白的超表达

越来越多的研究表明，在通过转基因等手段合成的外源性NGB的干预下使机体处于NGB超表达状态时，对于清除活性氧物质、减少一氧化氮损伤、神经退行性疾病发病的抵抗、创伤性脑损伤的保护等有着更为显著的作用。

2.2.1脑红蛋白超表达对于一氧化氮以及活性物质的清除线粒体是脑卒中及相关神经系统疾病中神经细胞存活和死亡的关键。活性氧(reactive oxygen species， ROS)是线粒体呼吸结束时的一部分电子通过复合物I和III向氧气泄漏产生的，而NGB可以维持线粒体ATP的水平，减少ROS的产生，并参与线粒体介导的细胞死亡信号。NGB转基因小鼠海马在缺血再灌注后的ROS与活性氮(reactive nitrogen species， RNS)的产生相比于野生型小鼠明显减少[13]。在NO处理后的野生型细胞和NGB转染的HN 33细胞之间比较NO诱导的细胞死亡的敏感性可以发现，NGB超表达使浓度毒性曲线向右移动，表明NGB可以降低对于NO诱导细胞死亡的敏感性[14]。相同NO浓度下脑红蛋白超表达的神经元与野生型神经元相比受到伤害较小，表明丰富的脑红蛋白缓冲NO，提高NO介导神经元损伤的阈值[15]。NGB清除ROS的机制可能是其64位点的组氨酸与ROS发生作用[14]或者与呼吸链组分之间的蛋白互作而清除ROS[13]。NGB和神经元一氧化氮合酶(nNOS)的高度共定位已在前基底内侧杏仁核、外侧下丘脑被检测到，表明NO可以作为NGB的内源性配体被直接绑定后清除[16]。

2.2.2脑红蛋白超表达对于神经退行性疾病的影响氨基乙磺酸(Tau)的高度磷酸化是阿尔兹海默症(AD)大脑的特征性病理标志，超表达NGB可以在多个糖原合酶激酶(GSK-3β)控制的AD相关位点抑制Tau高度磷酸化。 NGB通过激活Akt信号来减少Tau蛋白的过度磷酸化意味着AD治疗的又一标靶[17]。在常氧和缺氧条件下，十二个月的NGB超表达小鼠在固定梁上行为测试的行走距离相比野生型小鼠更远。NGB在小鼠基底神经节、大脑皮质、海马和小脑中表达较多。而这些大脑区域是容易受到与年龄相关的神经系统疾病如中风和神经退行性疾病的显著影响。老化状态的自由基理论认为与年龄有关的氧化应激的增加直接关系到与年龄有关的细胞功能下降[18]。因此， NGB超表达可以通过清除随着年龄增加的活性氧，抵消年龄增大引起的神经功能障碍。

2.2.3NGB超表达对创伤性脑损伤的保护作用在大鼠局灶性脑损伤模型中，NGB的表达在损伤1h后急剧增加，6h后达到高峰，随后逐渐下降。中度与重度的脑损伤引起的NGB升高相比于轻度损伤较为显著。NGB超表达转基因(Ngb-Tg)小鼠与野生型 (WT)对照小鼠同时遭受到创伤性脑损伤(Traumatic brain injury TBI)后，NGB表达均显著上调，而在TBI六小时后产生的氧化损伤生物标志物3硝基络氨酸(3-nitrotyrosine 3NT)在Ngb-Tg小鼠脑中相比与WT小鼠显著降低，并且Ngb-Tg小鼠相比于与野生型小鼠，在TBI三周后的损伤性病灶体积明显减小[19]。TBI后NGB起到显著的神经保护作用，从而可能对创伤性脑损伤治疗及预后有重要意义。

3　展望

NGB是一种内源性神经保护分子，在缺血缺氧，活性物质的清除，相关的神经系统疾病以及创伤性脑损伤中，尤其是在NGB超表达状态，起到极其重要的神经保护作用。随着NGB越来越多的功能以及假设机制被进一步阐明， NGB对大脑缺血缺氧，脑外伤，中风和相关的神经系统疾病等的神经保护作用和靶向疗法会被更深入的了解与应用。

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[责任编辑李麦产]

Neuroprotective effects of neuroglobin

School of Life Science, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

Neuroglobin is a hexacoordinate heme monomer globulin, which is mainly expressed in the nervous system ,and it can be expressed in other organs and tissues. In cultured neurons and in vivo, the over-expression of neuroglobin can decrease the neural injury. In addition, previous studies have also showed that neuroglobin can serve as an endogenous neuroprotective molecule. Over-expression of neuroglobin in scavenging reactive oxygen species, reducing the damage caused by nitric oxide, reducing the incidence of neurodegenerative diseases, and the protection of traumatic brain injury are more prominent. However, the mechanism of its neuroprotective effect is not fully understood. In this article, the structure, distribution and neuroprotective functions of the neuroglobin are briefly introduced.

neuroglobin; hexacoordinate structures; neuroprotection

1672-7606(2016)03-0225-04

2016-07-20

国家自然科学基金(31070952，U1204311)；河南大学省属高校科研项目(0000A40475, 0000A40356)

李直(1985-)，男，河南开封人，在读硕士生，从事生物医学的学习和研究。

邓锦波(1957-)，男，江西高安人，博士，教授，从事发育神经生物学的研究工作。

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