一种蓝藻生物量长期原位实时监测仪的研制*

杨　飞，陶志浩，郑贵林

（武汉大学自动化系，武汉430072）

一种蓝藻生物量长期原位实时监测仪的研制*

杨飞*，陶志浩，郑贵林

（武汉大学自动化系，武汉430072）

近年来，各类水体蓝藻水华灾害频繁发生，导致水体生态系统功能退化和破坏，并严重危害到水产养殖和用水安全。对水体中蓝藻生物量进行长期实时监测是防治蓝藻水华灾害的一项必要措施。基于蓝藻中所含藻蓝蛋白的特征荧光效应，即采用620 nm波长的强光激发出645 nm波长的荧光并通过检测其强度来推算水中蓝藻生物量，最终研制出了一种能对水体中活体蓝藻生物量实现原位快速监测的仪器，辅以专门设计的自清洗功能使之能长期免于人工维护和校准。为满足对广阔水域的时空分布动态监测的需要，采用GPS技术获得各测点地理位置信息，还采用无线通信技术实现其与监测中心的远程实时在线数据通信，藉此扩展了其实用范围。实验结果表明，蓝藻生物量与检测值的线性相关系数可达0.98以上，可见检测值能精确地反映蓝藻浓度的变化。

蓝藻生物量；原位监测；荧光效应；自清洗

EEACC：7230Jdoi：10.3969/j.issn.1004-1699.2016.05.025

蓝藻（Cyanobacteria）又称蓝细菌、蓝绿菌或蓝绿藻，是一种能进行产氧性光合作用的原核生物，其在地球上已存在了30多亿年，对地球表面从无氧的大气环境变为有氧环境起到了巨大的作用。近些年来，由于人类活动的影响，水体富营养化的现象屡见不鲜，这些水体中经常出现异常大量繁殖的蓝藻，极易堆积、腐烂沉降从而造成大面积水华现象，其危害十分巨大［1-2］。例如：蓝藻的大量繁殖恶化了水体中的通风、光照和含氧环境，破坏了水体生态系统，压缩了鱼类和其他生物的生存空间，且其产生的异味物质和毒素会严重影响到饮用水源和水产品的安全，乃至危害到人类身体健康。对水体中蓝藻生物量进行监测是预警和防治蓝藻水华灾害工作的重要环节［2-3］。同时，随着饮用水安全问题的日益突出，国内各主要湖区水库都已开始对水体的富营养化进行监测，蓝藻水华是水体污染的显著标志，也是水体富营养化的直观表征［4］。因此，对水体蓝藻生物量进行监测对水体富营养化程度评价也具有参考意义。

对于水体中蓝藻生物量的测定，传统的方法一般都是通过将采集的水样浓缩成标本后带回实验室，由专业分析人员在显微镜下观察统计蓝藻个体总数［5］。这种群落人工计数法对分析人员的专业素养要求很高，在实际工作中往往精度难以得到保证，而且需要耗费大量时间和人力；更重要的是，由于不能在原位进行快速检测，所以并不适应快速、连续的蓝藻预警和监测的需要。近些年来，为了满足对日益频发的蓝藻水华现象进行监控的需要，多光谱遥感技术开始在各国得到应用［4，6］。水体的光谱特征是由其中的各种物质对光辐射的吸收和散射性质决定的，即水体中蓝藻生物量浓度的差异，使水体颜色、密度、透明度等产生差异，从而使图像传感器上接收到的光谱特征存在差异，在遥感图像上反映为色调、灰阶、形态、纹理等特征的差别。基于此原理，可以通过研究水体反射光谱特征与水体浮游生物量之间的关系建立反演算法。尽管使用遥感技术监测蓝藻具有可快速同时监测大面积水域的优点，但因遥感图像数据来自于搭载在各种遥感平台上的传感器，其成像效果容易受到云层等因素的影响［7］，所以只能用于大致判别蓝藻水华是否已经大面积暴发，并不能精确地监测蓝藻水华暴发前水体中蓝藻生物量的变化过程。因此需要研究满足对水体各处蓝藻生物量进行长期原位监测的仪器，而荧光法可能是目前最具现实应用价值的检测方法。自Lorenzen［8］率先利用叶绿素的荧光效应成功地连续检测海水中活体叶绿素a的浓度后，利用此原理检测水中浮游植物生物量已是被广为接受的检测方法［9-11］。由于叶绿素a在各种浮游植物中广泛存在，蓝藻中也含有叶绿素a，故难以通过叶绿素的荧光效应从浮游植物群落中准确区分出其中蓝藻的生物量。本文根据蓝藻中特有的藻蓝蛋白的荧光效应，研制出一种能对水体中蓝藻生物量进行原位快速检测的仪器。研究中还发现，由于这类利用荧光效应原理的原位检测仪在各类水体中的工作时，仪器中长期与水体直接接触的光学部件都将不可避免地受到水体中各种杂质或浮游植物等的粘附，将会阻碍激励光和发射光的传播路径，导致蓝藻活体受照射的和检测到其发射的光强均会减弱，从而会导致蓝藻生物量检测结果比真实值偏低，这一现实应用中存在的问题在公开文献中鲜有提及。为了尽量延长蓝藻浓度监测仪的人工维护周期并降低使用成本，本文所研制的仪器专门设计有自清洗装置，可对光学核心部件进行自动清洗，防止有害的粘附。另外，为满足对广阔水域的时空分布动态监测的需要，通过采用GPS技术获得各测点位置信息，还采用无线通信技术实现其与监测中心的远程实时数据通信，藉此扩展了其实际应用范围。

1　荧光法检测原理

当用高强度的光射入某种物质时，该物质中的电子吸收能量从基态跃迁到高能级，此时由于电子处于高能级非稳态，就会从高能级跃迁至低能级，从而释放能量发出波长更长的光，这种现象称为荧光效应。一般情况下，单位体积内这种具有荧光效应的物质越多，在同样强度的激励光照射下，释放出的荧光强度也就越大。由于激励光和发射荧光的波长不同，因此只要选择一组合适的窄带带通滤光片，即可将激励光和发射荧光区分开来，从而可达到通过检测发射荧光强度来度量该物质浓度的目的，这就是荧光法检测的基本原理。研究发现［12］，当用可见光照射蓝藻时，其所特有的藻蓝蛋白在受强光激励后会立即以辐射跃迁形式将其吸收的能量释放出，同时会发射出中心波长为645 nm的荧光，其吸收光谱主要是620 nm左右的可见光。

根据藻蓝蛋白的这种特征荧光效应，本文采用一种中心波长为620 nm的单色光照射待测水样，以激发出中心波长为645 nm的荧光，然后通过检测所激发荧光的强度进而推算出水样中蓝藻生物量浓度值。发射的激励光谱避开了叶绿素a在可见光波段的2个最强吸收区：波长为640 nm～660 nm的红光波段和波长为430 nm～470 nm的蓝紫光波段，因此能大大降低水样中所含叶绿素a对检测结果的干扰。使用这种方法检测蓝藻生物量，其待检测水样不需要预处理和等待，特别适合在原位快速检测水体中各处的蓝藻生物量。

研究表明，物质激发出的荧光强度F与其摩尔吸光系数ε、浓度c、荧光效率φ、样品的光程b、荧光检测仪器常数k及激励光强度I0有密切关系。当待测物质及检测仪器确定后，ε、φ、b、k均为常数。根据Beer-Lambert定律，物质的荧光相对强度可用下式表示［9］：

展开式（1）中的指数项后可得：

当εcb的值很小时，式（2）中括号内的展开项第二项及其后项可忽略不计，它可简化为：

由式（3）可见，在某一固定频率和强度为I0的入射光激励下，发射的荧光强度与该物质的溶液浓度成正比。因此通过检测接收到的激发荧光的强度即可推算出蓝藻生物量浓度值。

2　系统设计与实现

2.1系统结构设计

本文设计的蓝藻生物量监测仪系统如图1所示，它以单片机MCU作为控制核心，主要由激励光源子系统、荧光检测子系统、清洗子系统和通信子系统组成。

图1　系统设计框图

下文将对各关键子系统给出详细设计说明。监测系统的主要工作流程如图2所示：首先单片机控制水泵将水样抽取至检测腔，接着激励光源子系统调制发射波长为620 nm的发光二极管（LED）光源对检测腔中的水样进行照射，同时荧光检测子系统中的光电转换器件（高灵敏光敏管）接收蓝藻体内的藻蓝蛋白受激发出的荧光并转变为电流信号，再经过I/V转换、放大、滤波、检波等信号调理后进行A/D转换，然后由单片机读取A/D转换后的数据即为检测结果。最后，单片机还需控制水泵对检测腔内部进行冲洗并排干水。水样被抽至检测腔内后，从控制LED发射激励光到读取到发射荧光转换成的电压值的所用时间极短，能满足实时检测的需要。该系统在野外工作，因此采用了太阳能板和蓄电池供电。

考虑到现实应用中往往需要对大面积水域进行多点同时监测，且监测点往往会设在离岸边较远的水中。因此监测仪还专门设计有数据远传通信接口，既可通过RS485有线通信方式或Zigbee无线模块将监测数据传输至几公里以内的本地监测中心，还可连接GPRS/3G/4G公网无线通信模块将检测数据远程传送到任意地点的接有互联网的监测中心，并可接收监测中心的控制指令。根据需要，监测仪还可外接GPS模块，通过读取其授时时间和经纬度数据得到所在地的准确时间和地理位置，监测中心可利用这些数据和GIS地理信息系统实现对广阔水域的时空分布动态监测。

图3为本文所设计的监测中心上位机软件的工作界面。图3中横轴表示时刻，其单位是小时，纵轴表示蓝藻浓度值，其单位是cells/mL，该实时曲线为当天0∶00～15∶00每隔1h自动检测1次的蓝藻实时浓度值。

图2　系统主要工作流程示意图

图3　监测中心上位机软件工作界面

2.2仪器机械结构设计

在仪器的机械结构设计中，由于检测腔是整个检测仪器的核心装置，所以必须进行重点考虑。如图4所示，本文所设计的检测腔装置主要包括：①激励光源腔，用于安装LED光源，向下发射光照射检测腔中的水样；②激励光路带通滤光片，将LED发出的光进行过滤，仅使620 nm左右窄带内波长的光通过射入下方的待测水样；③清洗喷嘴，用于泵入高速水流冲洗对面的检测窗口；④检测腔体，该腔体为遮光密闭结构，内壁加工光洁度要求高，以尽量减少杂物粘附且便于清洗；⑤接收光路带通滤光片，仅使650 nm左右窄带内波长的光进入到右边荧光接收模块；⑥检测窗前端半球凸透镜，用于汇聚水样中蓝藻受激产生的微弱荧光；⑦荧光接收模块，用于将接收到荧光信号转换成电信号；⑧排水口，与双向泵连接，用来将水样泵入到检测腔进行检测，检测完后再由此排出，避免水样在检测腔体中长期浸泡后粘附到检测窗表面。

图4　检测腔装置结构示意图

该检测腔装置的实物图见图5左图上部分黑色主体部分。图5左图下部分的金属盒为仪器的电气控制部分，其内部结构和接线如图5右图所示。

图5　仪器样机及其内部电路照片

2.3激励光源子系统

对于激励光源子系统而言，由于水体中的蓝藻（藻蓝蛋白）含量通常较低，因此需要保证激励光源的亮度足够大。针对藻蓝蛋白的光学吸收特性，本文所设计的仪器选用中心波长为620 nm的多个高亮LED作为激励光源。相比以往研究中广泛使用的氙灯或氦氖激光器，采用LED作为激励光源具有体积小、功耗低、散热小、响应快、寿命长、单色性好和工作电压低等优点，适用于在野外工作的小型仪器。其下安装了中心波长为620 nm的窄带滤光片，其半波带宽为10 nm，以尽量保证只有所需的特征波段的激励光线射入水样。LED的发光强度由驱动电流决定，驱动电流的大小和波动都会直接影响LED激励光源的激励效果，进而对仪器的稳定性和可靠性有很大的影响。在本系统中，激励光源驱动电路采用GS6300为LED提供恒定的驱动电流，以获得稳定的激励效果。GS6300是一款高效率、恒流、恒压芯片，输入电压范围为4.5 V～40 V，方便在野外使用时用电池供电，输出电压1.3 V～37 V可调节，输出电流可高达3A。LED恒流驱动电路如图6所示，其输出电流值为1.55 A，在-40～125℃范围内能稳定工作。MOSFET管与LED串联接至驱动电路的输出端，并由MCU控制MOSFET管的导通和截止来控制LED激励光源的启停。

图6　LED恒流驱动电路

2.4荧光检测子系统

由于水体中的蓝藻即使是在强光激励下发射的荧光，其光强依然很弱，因此荧光接收检测系统需要具有很高的灵敏度，从而保证整个系统设计的有效性。将接收到的荧光转换成电信号的光接收器件的灵敏度在很大程度上决定了检测性能。常用的光接收器件有光电池、光敏电阻、光敏管、光电倍增管等。本文选用日本滨松公司的S1336光敏管作为接收荧光的传感器，其在波长为645 nm左右波段的光灵敏度可达0.35 A/W。需要指出的是，在以往荧光检测研究中广泛使用的光电倍增管虽然灵敏度很高，但其工作电压非常高，体积也较大，比较适合应用于实验室检测仪器中，难以满足野外现场使用中对功耗和体积的要求，因此本文挑选了工作电压低、体积小便于集成的光敏管来实现光电转换。

为了更好地接收特征波长的荧光，在光敏管感光窗口前安装了半球凸透镜用于汇聚荧光光线，还安装了中心波长为650 nm带通滤光片（半波带宽为10 nm），以阻止激励光线在水样中被折射和反射后形成的杂散光射向光接收器件。由于激励光和发射荧光的波段相隔较近，因此尽管发射荧光的峰值波长为645 nm，但本文在选择接收滤光片时没有选择中心波长为645 nm的带通滤光片，而是选择了中心波长为650 nm带通滤光片，以尽量消弱激励光源射向光敏管的光线。

2.5清洗子系统

原位监测相比取样送检具有很多的优点，它能真实并且快速地测得所选测点处水体的蓝藻生物量变化情况，但也比检测技术提出了更高的要求。水体蓝藻原位监测常要求监测仪就近安装或直接浸于水中，对仪器的校准或维护常受到野外水域环境的制约不便经常开展，而蓝藻的防治又恰恰需要对水体进行长年的不间断监测。蓝藻监测仪在长时间的使用过程中，仪器中长期与水体直接接触的光学部件都将不可避免地受到水体中各种杂质或浮游植物等的粘附，这将阻碍激励光和发射光的传播路径，导致蓝藻活体受照射的和检测到其发射的光强均会减弱，从而蓝藻浓度检测结果比真实值偏低，严重影响了监测结果的准确性。针对类似问题，传统的水质传感器均采用人工维护的办法，即定期将传感器取出，人工清洗传感器表面和内部污垢及附着微生物，有时还需进行再次标定和校准。在维护期间，监测过程被强行中断，不但存在维护技术难度和成本的问题，而且维护过程往往繁琐耗时，如此会使相关人员疲于维护或懒于维护，因此可能还会因此导致监测结果不可信的后果。

针对这一问题，本文专门设计了自维护技术，利用双向水泵先将水样抽入检测腔，待测完后再完全排出，避免水样长期浸泡光学检测窗。在光学检测窗对面专门设计有一个清洗喷嘴，每次检测完成后使用一定的压力将清洗液喷至光学检测窗，以冲洗可能粘附在其上的各种杂质，再由双向泵排出清洗液，反复多次还可达到清洗检测腔内部的目的。冲洗液可以是取自附近水体并经过滤后的净水，也可配备其他对水体无害无污染的洗涤液。这种方法实用有效，针对性强，且不会大幅增加仪器的成本。

3　实验结果

为验证监测仪对真实水体中蓝藻生物量的检测效果，分别于2015年9月6日和10月26日从武汉市沙湖湖内取得1号水样和2号水样，各自测定水样中蓝藻的特征荧光强度，即通过读取荧光强度检测输出的电压值，获得水样中蓝藻生物量的相对测算值。实验时，将取得的原始水样以蒸馏水等比例稀释成不同倍数，再利用本监测仪分别检定稀释后的水样，检测值结果见表1和表2所列，每个数据皆为重复检测5次后所求的平均值，在现场监测中也是依此方法求均值来得到最终检测值。另外，还将这2次检测实验中的荧光强度值与水样相对浓度值进行线性拟合，如图7所示。

表1　1号水样测量实验数据

表2　2号水样测量实验数据

图7　水样实验测量结果

由图7可见，水样的相对浓度与电压值呈良好的线性关系，检测值能较好地反映稀释浓度变化。1号水样所对应的线性回归方程为y=2 835.2x+676，相关系数为0.994 5；2号水样所对应的线性回归方程为y=649.8x+642，相关系数为0.988 4。1号水样与2号水样取样时间相隔50 d，虽然它们的检测结果都具有良好的线性关系，但是它们的检测值相差很大。分析其原因可得：10月份与9月份相比，水体平均温度相对较低且光照较弱，从而导致蓝藻的生长缓慢，浓度明显下降，这一现象符合湖泊中蓝藻的生长规律。其线性相关系数变化不大，说明仪器的检测一致性较好。故此可见通过真实水体水样验证了本监测仪对蓝藻生物量具有较高的检测准确度。通过群落人工计数法对水样中的蓝藻进行标定后，得到监测仪的最低检出限值约为0.6×103cells/mL，通过标准蓝藻溶液标定得到该监测仪在低放大倍数档时的线性区域上界为1.9×105cells/mL。用不含蓝藻的浮游植物混合液进行同样的实验，多次成倍稀释后的检测值无明显变化，几乎总是保持在590 mV左右这一水平。这是因为藻蓝蛋白是蓝藻中所特有的一类荧光物质，其他浮游植物群落基本上不含藻蓝蛋白，因此不能激发出相同特征波长的荧光而被仪器检测到，所以其检测值亦不能反映混合液的浓度变化。

4　结论

本文利用蓝藻中藻蓝蛋白的特征荧光效应，自主研制出了一种可用于河流、湖泊、水库、海洋等水体环境的蓝藻生物量监测仪，它具有实时在线、长期免维护以及支持广阔水域时空分布监测的功能。该仪器主要由激励光源子系统、荧光检测子系统、清洗子系统和通信子系统组成，具有小型化、低功耗、检测速度快等特点。相对国外蓝藻生物量检测仪器，具备成本低，结构简单，维护周期长，通信接口丰富便于扩展等优势。蓝藻生物量检测实验结果表明，其检测值与蓝藻浓度值具有良好的线性关系，检测灵敏度和准确度较高。该仪器可广泛应用于湖泊蓝藻水华的监测和预警，以及海洋环境污染调查、渔情预报、海产养殖的水质监测与控制等，应用前景十分广阔。

［1］Otten T G.，Paerl H W.Health Effects of Toxic Cyanobacteria in US Drinking and Recreational Waters：Our Current Understand⁃ing and Proposed Direction［J］.Current Environmental Health Re⁃ports，2015，2（1）：75-84.

［2］李媛，张家卫，魏杰，等.我国蓝藻水华的发生机理、危害及防控利用研究进展［J］.微生物学杂志，2015，35（4）：93-97.

［3］黄君，张虎军，江岚，等.太湖蓝藻水华预警监测综合系统的构建［J］.中国环境监测，2015，31（1）：139-145.

［4］黄君，庄严，宋挺，等.3S技术在太湖富营养化和蓝藻水华分布规律中的应用研究［J］.环境污染与防治，2014，36（12）：31-37.

［5］国家环保总局.水和废水监测分析方法（第四版，增补版）［M］.北京：中国环境科学出版社，2002：701-707.

［6］Lunetta R S，Schaeffer B A，Stumpf R P，et al.Evaluation of Cyano⁃bacteria Cell Count Detection Derived From MERIS Imagery Across the Eastern USA［J］.Remote Sensing of Environment，2015，157：24-34.

［7］Wang G，Li J，Zhang B，et al.Monitoring Cyanobacteria-Dominant Algal Blooms in Eutrophicated Taihu Lake in China with Synthet⁃ic Aperture Radar Images［J］.Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2015，33（1）：139-148.

［8］Lorenzen C.A Method for Continuous Measurement of In Vivo Chlorophyll Concentration［J］.Deep-Sea Research，1966，13：223-227.

［9］金海龙，王玉田.基于荧光发射光谱的活体海藻识别方法研究［J］.传感技术学报，2006，19（1）：97-111.

［10］金海龙，王玉田.基于荧光法和多元回归分析的混合海藻识别方法研究［J］.传感技术学报，2006，19（4）：1198-1201.

［11］崔建升，吕鹏翼，段莉丽.海水叶绿素现场检测仪的研制及性能研究［J］.分析仪器，2014（1）：12-16.

［12］Lee T，Tsuzuki M，Takeuchi T.et al.In Vivo Fluorometric Method for Early Detection of Cyanobacterial Waterblooms［J］.Journal of Applied Phycology，1994（6）：489-495.

杨飞（1981-）男，博士，讲师，本文通讯作者，现主要从事智能传感器与检测技术方面的研究工作，young-free@tom.com；

陶志浩（1989-）男，硕士研究生，主要为研究方向测控技术与仪器；

郑贵林（1963-）男，博士，教授，博士生导师，现主要为从事智能传感器与检测技术方面的研究工作。

Design of a Long-Term and Real-Time In-Situ Monitor for Cyanobacterial Biomass*

YANG Fei*，TAO Zhihao，ZHENG Guilin
（Department of Automation，Wuhan University，Wuhan 430072，China）

In recent years，cyanobacterial blooms occurred frequently in kinds of water bodies，which resulted in deg⁃radation and impairment of water ecological function，as well as serious harm to aquaculture and other water utiliza⁃tion.The long-term and real-time monitoring of cyanobacterial biomass in water bodies is an essential measure to prevent and harness cyanobacterial blooms.Based on phycocyanin fluorescence from vivo cyanobacteria，the strength of the fluorescence at 645 nm excited by the 620 nm bright light is detected to evaluate the cyanobacterial biomass in water，and finally a rapid and in-situ monitoring instrument for cyanobacterial biomass in water bodies is developed，supplemented by a specially designed self-cleaning device to keep from manual maintenance and calibra⁃tions for long-term monitoring.To meet the demand of dynamic monitoring of the temporal and spatial variation of cy⁃anobacterial biomass in vast water areas and expand the practical range，the GPS technology is utilized to obtain the geographical position information of each monitoring site，and the wireless communication technology is employed to realize the remote real-time online data communication among monitoring sites and the monitoring centre.The exper⁃imental results show that the linear correlation coefficients of the cyanobacterial biomass and the detection values ex⁃ceed 0.98，and thus the detection values could reflect the variations of the cyanobacterial concentration accurately.

cyanobacterial biomass；in-situ monitoring；fluorescence effect；self-cleaning

X85

A

1004-1699（2016）05-0769-07

项目来源：水利部科技推广项目（TG1150）；国家海洋局“海洋可再生能源专项资金项目”（GHME2013JS01）；广东省海洋经济创新发展区域示范专项项目（GD2012-C03-006）

2015-12-01修改日期：2016-01-21