现场快速检测大田软海绵酸的传感器与仪器的研究*

邱先鑫，苏凯麒，田玉兰，邹瞿超，方佳如，李　蓉，王　平*

（1.浙江大学生物传感器国家专业实验室，生物医学工程教育部重点实验室，生仪学院，杭州310027；2.中科院传感技术国家重点实验室，上海200050）

现场快速检测大田软海绵酸的传感器与仪器的研究*

邱先鑫1，2，苏凯麒1，田玉兰1，邹瞿超1，方佳如1，李蓉1，王平1，2*

（1.浙江大学生物传感器国家专业实验室，生物医学工程教育部重点实验室，生仪学院，杭州310027；2.中科院传感技术国家重点实验室，上海200050）

研究并建立针对大田软海绵酸OA（okadaic acid）快速、有效的酶联免疫吸附试验ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）定量检测方法，制备了定量检测试剂盒-生物酶传感器，并研发配套的现场快速检测仪器-仿生电子眼（Bionic e-Eye），实现对OA的快速检测。对标准样品的参数进行测定，该OA试剂盒的检测限为0.19 μg/L，检测范围为0.2 μg/L～5 μg/L；样品回收率为75%～125%，精密度在±15%以内。将Bionic e-Eye的检测结果和酶标仪及高效液相色谱HPLC（high performance liquid chromatog⁃raphy）所测数据的结果进行了比较，结果表明，Bionic e-Eye的性能与酶标仪的检测结果一致。此外，该仪器可以直接得出检测结果，不需要人工计算处理，适用于现场的快速检测，将是一种新的现场快速定量检测OA的技术手段。

生物传感器；大田软海绵酸；仿生电子眼；试剂盒；ELISA

EEACC：7230Jdoi：10.3969/j.issn.1004-1699.2016.05.001

大田软海绵酸（OA）是由鳍藻和原甲藻产生的一种脂溶性的海洋生物毒素。不同种类贝类通过食用海洋藻类实现了生物毒素在贝类中的富集。这种毒素被不同种类贝类食用，虽然该毒素不影响贝类，但人类在食用受污染的贝类后，会引起腹泻性贝类中毒（DSP）和胃肠道紊乱。通过动物实验，OA已经被证明了具有致癌性，致突变和免疫毒性。欧盟委员会（EC）规定贝肉中的最大浓度不超过160 μg/kg（EC号853/2004 15）［1-4］。小鼠生物法曾被作为测定OA的标准方法。但其选择性和精度较低且涉及到伦理问题，于2011年1月已被禁止。Stengel团队［5］采用高效液相色谱-质谱联用的方法和Steve团队［6］采用的HPLC-荧光方法灵敏度高、结果准确，但设备非常昂贵、耗时、也需要熟练的操作人员，且对样品前处理有较高要求，不利于将其发展为现场检测技术。柳其芳［7］和Sassolas等人［8］采用酶标仪配合ELISA方法被用于实验室内的OA毒素浓度评估，但其体积较大，速度较慢，数据后处理复杂，也不适合样品的现场快速检测和筛选。其他技术如细胞传感器等也被用于贝类毒素的检测，但也不利于实现现场快速检测［9-12］。因此迫切需要高度敏感的方法来实现快速检测贝肉中的OA毒素。本文研究并建立针对大田软海绵酸快速、有效的ELISA定量检测方法，其中包括制备针对OA的定量检测试剂盒-生物酶传感器，并且基于生物酶传感器设计一种OA毒素的现场检测系统，即Bionic e-Eye。该Bionic e-Eye系统以移动终端作为分析平台，开发了iPlate数据处理软件，具有通量高、速度快、操作简单、便携等特点［13］。本文将介绍该系统的原理和组成，并且通过和酶标仪及商用试剂盒比较及毒素检测实验验证系统的可行性。

1　材料与方法

1.1试剂和仪器

大田软海绵酸（OA）；牛血清白蛋白（BSA）；碳二亚胺（EDC）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）；乙醇；大田软海绵酸单克隆抗体；辣根过氧化物酶；3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）；磷酸盐缓冲液（PBS）；碳酸盐缓冲液；Tween 20；二甲基亚砜（DMSO），Beacon Okadaic Acid试剂盒。透析袋；涡旋振荡仪；磁力搅拌器；酶标仪；Bionic e-Eye；超纯水机，电子天平。

1.2系统原理

将合成的OA-BSA偶联体包被在多孔板上，OA-BSA与加入的OA标准品或待测样品竞争性结合HRP标记的OA单克隆抗体，OA浓度越高，OA-BSA竞争性结合的OA抗体-HRP越少，因此HRP催化发生的化学反应产物越少，显蓝色越浅，反之，则显蓝色越深，加入终止液后，溶液显黄色，这样就形成了浓度依赖的颜色梯度，根据仪器检测数据绘制标准曲线，然后通过标准曲线来计算出待测样品的浓度。

在智能手机的基础上，我们开发了基于试剂盒-酶传感器的比色系统Bionic e-Eye仪器，由智能手机或pad平板终端（iPhone 4s或iPad 3）作为检测仪器和一个暗箱构成，暗箱中内嵌广角镜头，并用一块低功耗冷光片用来提供光源。图1为该系统检测过程，将96孔微孔板放置在箱内多孔板装载台上，位置于冷光片上，通过手机后置相机Bionic e-Eye摄像头捕获到检测图像，然后系统通过提取的待测物的颜色分量值，并选用检测分析性能最好的颜色通道建立内置标准曲线，根据标准曲线计算出待测物的浓度并直接显示在自制App-iPlate软件界面上。Bionic e-Eye的图像处理算法用到和人类视觉系统相似的色调，饱和度和亮度（HSV，也称为六角锥体模型）颜色模型来进行图像处理。iPlate采用Objective-C语言进行开发iPlate软件。在高通量的检测中，Bionic e-Eye采用光学图像检测具有高通量同时检测的性质，且光学图像检测具有同时和同步性，且iPlate无需借用计算机等进行线下处理，所以非常适用于现场检测。而酶标仪通过机械结构达到高通量的检测是异步的。高通量同时检测比异步检测具有更高的准确性。因此，Bionic e-Eye在临床应用、工业质量控制、环境监测、和食品评估领域将是理想的比色检测设备。

图1　基于试剂盒的现场检测系统原理图

1.3方法

1.3.1包被抗原OA-BSA的制备

取OA粉剂溶解于DMSO中，然后加入碳二亚胺（EDC）以及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（溶解在MES（pH=5.5）），室温振荡500 r/min，2 h。将BSA溶液（溶解在0.01 mol/L PBS缓冲液（pH=7.2～7.4）中）逐滴加入上述活化的OA溶液中，离心管震荡速度为1 000 r/min，反应4 h。将上述合成的OA-BSA加入到经前处理后的透析袋中，置于烧杯中透析，透析液为上述PBS，每隔8 h换一次透析液，共4次。之后将透析袋内的液体吸出，4℃备用。

1.3.2OA-BSA、HRP-抗体最佳稀释比例的确定

用直接非竞争ELISA法作棋盘滴定，包被抗原OA-BSA按1∶200、1∶300和1∶400稀释，每个浓度3个重复孔，空白组加入1 μg/mL的OA溶液。HRP-抗体溶液，稀释比例为1∶2 000，1∶3 000，1∶4 000，用竞争性ELISA方法作标准曲线，选择OA-BSA的最佳稀释比例和酶标记抗体的最佳稀释比例。

1.3.3试剂盒的制备与储存

用最佳OA-BSA和HRP-抗体稀释比例，向多孔板中加入100 μL最优稀释比例OA-BSA，室温下孵育1 h。3次洗板后用质量分数为1%的BSA封闭液进行封闭，室温封闭1 h，三次洗板后，4℃密封干燥保存。试剂盒中还包括上述PBST溶液、HRP-抗体溶液、TMB底物，终止液HCl。将试剂盒密封4℃保存，即得到大田软海绵酸试剂盒。

1.3.4试剂盒的使用方法

向试剂盒中的多孔板中第1列每孔加入100 μLOA标准品，标准品浓度为（0、0.2、0.5、1、2、5）μg/L，向其它列加入其它浓度或者待测OA样品溶液，然后加入50 μL HRP-抗体溶液，室温反应30 min后用PBST溶液洗板三次，最后加入100 μL TMB底物，室温反应30 min后，用酶标仪和iPlate软件进行检测。

1.3.5试剂盒参数测定

精密度和回收率：按照试剂盒的使用方法，向多孔板中加溶液，OA浓度为（0、0.2、0.5、1、2、5）μg/L，每种浓度三个重复孔，用以作标准曲线。加标浓度为（40，80、160）中μg/kg，每种浓度6个孔，加标5次，用以测定试剂盒的精密度（精密度=6个重复孔测量得到的值的标准方差/平均值）和回收率（6个重复孔得到的值的平均值/真实值），以及空白对照组6个孔，用以计算试剂盒的检测限（浓度为0的标准品组6个重复孔测量得到的浓度平均值+3倍的浓度标准方差）。

1.3.6自制试剂盒与商用试剂盒进行对比以及该

系统与酶标仪和HPLC检测实际样品的对比按照商用Beacon试剂盒的说明书进行检测，并和自制试剂盒进行比较。同时，用iPlate和酶标仪对自制试剂盒进行检测以测试iPlate的准确性。并将试剂盒检测结果和HPLC进行比较。

2　结果与讨论

2.1自制试剂盒参数测定

经过棋盘滴定，OA-BSA的最佳稀释比例为1∶300，抗体-HRP的最佳稀释比例为1∶3 000。表1为贝肉样品加标的回收率和变异系数，由表可见，加标浓度为40 μg/kg的样本回收率为79.30%～109.05%，变异系数为12.55%，加标浓度为80 μg/kg的样本回收率为83.39%～112.04%，变异系数为12.19%，加标浓度为160 μg/kg的样本回收率为78.67%～104.81%，变异系数为11.60%，三个加标浓度的平均回收率均能达到75%～125%的技术要求，变异系数也均在15%以内。根据1.3.5中的方法计算得到试剂盒的检测限为0.19 μg/L，达到商用试剂盒的检测水平。

表1　贝肉样品加标的回收率和变异系数

2.2自制试剂盒和Beacon OA试剂盒比较

分别对自制的试剂盒和Beacon OA试剂盒用酶标仪进行检测，比较两种试剂盒的一致性。酶标仪测定的本试剂盒和商用Beacon试剂盒的标准曲线如图2所示。自制试剂盒能达到商用试剂盒的动态检测范围0.2 μg/L～5.0 μg/L，与Beacon OA试剂盒的标准曲线有较好的一致性，说明自制试剂盒的有效性。

图2　自制试剂盒和Beacon OA试剂盒标准曲线

2.3酶标仪和iPlate分别对自制的试剂盒进行检测及3种方法检测实际样品的对比

用酶标仪和Bionic e-Eye对自制试剂盒进行检测，制定标准曲线，并对贝类盲样进行OA毒素的检测同时比较3种检测系统的一致性。

图3为酶标仪和iPlate两种仪器测定的试剂盒的标准曲线。酶标仪（斜率为-0.45，线性相关系数为0.98）与Bionic e-Eye（斜率为-0.42，线性相关系数为0.96）具有相同水平的检测性能。表2为用3种方法检测盲样的结果，样本号为2、10、13、14和15的盲样能检测出贝肉中的OA的浓度，而其他样本中所测浓度小于10 μg/kg（前处理过程中稀释50倍，所以换算成贝肉中的线性范围下限是10 μg/kg），虽不在试剂盒的线性检测范围内，但低于欧盟所规定的出口标准（160 μg/kg）。此外，iPlate对实际样品中OA的浓度的检测值与酶标仪和HPLC的检测结果展现了一致性。

图3　酶标仪和Bionic e-Eye检测自制试剂盒的标准曲线

表2　iPlate与酶标仪及HPLC检测实际样品比较

3　总结

OA毒素的致腹泻、致癌，致突变和免疫毒性等生物毒性对人的健康有着严重的危害，因此，监测贝肉中OA毒素的含量具有重要意义。本研究研制了具有我国自主知识产权的OA定量检测试剂盒，其检测限为0.19 μg/L，检测范围为0.2 μg/L～5.0 μg/L，达到了国外同类试剂盒的技术指标，同时配套研发的基于移动终端的Bionic e-Eye用于OA毒素的现场检测，能够达到商用酶标仪在实验室环境下的检测水平。综上所述，本实验设计的试剂盒和仿生电子眼在实现高通量，准确检测OA毒素的同时，还具有体积小方便携带，处理速度快，很好的人机交互体验等优势，非常利于现场检测，填补了OA毒素现场检测仪器的空白，因此具有良好的研究价值和实际应用前景。

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邱先鑫（1990-），女，浙江大学生物医学工程2014级硕士研究生，从事生物医学工程与生物医学传感器研究，xianxin⁃qiu@zju.edu.cn；

王平（1962-），男，浙江大学，教授，博士生导师，主要研究方向为传感器与检测技术、生物芯片与生物电子学、人工嗅觉与人工味觉等，cnpwang@zju.edu.cn。

The Research of Biosensor and Bionic e-Eye for Rapid Detection of Okadaic Acid on-Site*

QIU Xianxin1，2，SU Kaiqi1，TIAN Yulan1，ZOU Quchao1，FANG Jiaru1，LI Rong1，WANG Ping1，2*
（1.Biosensor National Special Laboratory，Key Laboratory for Biomedical Engineering of Education Ministry，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China；2.State Key Laboratory of Transducer Technology，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200050，China）

Based on Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），test kit，namely，enzyme sensor and the corre⁃sponding instrument was prepared，Bionic e-Eye for rapid，effective and quantitative detection of okadaic acid（OA）on-site.The detection limit of the kit is 0.19 μg/L and the range is among 0.2 μg/L and 5 μg/L.The recovery rate is among 75%and 125%and the accuracy is within±15%.The performance of Bionic e-Eye is consistent with micro⁃plate reader and high performance liquid chromatography（HPLC）.In addition，without artificial calculation，the instrument can show the results directly on the screen，which is very suitable for rapid detection，and will be a new technology for rapid and quantitative detection of OA on site.

Biosensor；Okadaic Acid；Bionic e-Eye；Kit；ELISA

R318

A

1004-1699（2016）05-0633-04

项目来源：国家海洋公益专项项目（201305010）；教育部博士点基金项目（20120101130011）；国家自然科学基金项目（31571004）

2015-12-16修改日期：2016-01-18