脑缺血/再灌注致心肌损伤大鼠心肌内皮素和降钙素基因相关肽的变化

符少萍　王吉文　黄子通　陈焕清

(中山大学孙逸仙纪念医院预防保健科，广东　广州　510120)



脑缺血/再灌注致心肌损伤大鼠心肌内皮素和降钙素基因相关肽的变化

符少萍王吉文1黄子通1陈焕清

(中山大学孙逸仙纪念医院预防保健科，广东广州510120)

目的探讨内皮素(ET)-1和降钙素基因相关肽(CGRP)在大鼠脑缺血/再灌注期间心肌中的变化以及在继发心肌损伤中的作用。方法将大鼠随机分成假手术组(n=48)、脑缺血组(n=80)、再灌注组(n=80)，通过栓塞右侧大脑中动脉(MCAO)法制备脑缺血/再灌注模型，测定脑缺血及再灌注0、6、12、24、48、72 h的脑缺血区域面积、血清肌酸激酶-同工酶(CK-MB)浓度、心肌中ET-1、CGRP含量变化，比较各指标在同一时点及不同时点间的变化以及分析CK-MB、ET-1、CGRP之间关系。结果脑缺血组血CK-MB、心肌ET-1均逐渐升高，12 h达峰值，其后逐渐下降；心肌CGRP于6 h开始下降，12 h达最低值，其后逐回升。 再灌注组CK-MB、ET-1 均于12 h达到峰值，其后下降，CGRP于12 h达最低值，其后回升。缺血组、再灌注组ET-1/CGRP均在6 h开始升高，12 h达峰值，其后逐渐下降，在72 h仍明显高于0 h(P<0.05)。与脑缺血组比较，再灌注组脑缺血面积在 24、48、72 h 明显减少(P<0.05)，CK-MB、ET-1 在 6、12 h明显升高(P<0.05)，CGRP在 6、12 h 明显降低(P<0.05)。血CK-MB与心肌ET-1/CGRP相关(r=0.547 7，P<0.05)。心肌病理表现为炎性细胞浸润、心内膜炎、肌纤维变性、灶性坏死等。结论心肌ET-1、CGRP参与脑缺血/再灌注后的继发心肌损伤过程，心肌损伤程度与心肌ET-1升高程度、CGRP降低程度有关。

脑缺血/再灌注；内皮素-1；降钙素基因相关肽；心肌损伤；肌酸激酶-同工酶(CK-MB)

早期溶栓再灌注是临床上治疗缺血性脑卒中常用的方法，内皮素(ET)是强有力的内源性血管收缩肽，降钙素基因相关肽(CGRP)是内源性保护心肌的神经多肽，急性脑缺血再灌注后血中ET-1分泌增加、CGRP分泌减少〔1〕，但有关心肌中ET-1和CGRP的变化以及它们在继发心肌损伤中的作用报道甚少。为了解急性脑缺血后心肌中ET-1 和CGRP的变化及再灌注对其的影响，探讨二者在脑缺血/再灌注术后心肌损伤中的作用，本研究采用大鼠脑缺血/再灌注模型对心肌中的ET-1和CGRP含量变化及其与血中CK-MB的关系进行研究。

1　资料与方法

1.1动物将健康月龄6～8个月、体质量220～250 g的208只雄性SD大鼠(中山大学动物实验室提供)随机分成3组：假手术组(对照组，n=48)；脑缺血组(n=80)；再灌注组(n=80)。再根据脑缺血时间将脑缺血组、再灌注组则随机分成 6、12、24、48、72 h 共5小组(n=16)，将假手术组随机分成 0、6、12、24、48、72 h共6小组(n=8)，其中假手术组的0 h作为3组的共同0时点。

1.2方法

1.2.1模型制定以顶端烫制成光滑球状(直径0.25～0.30 mm)的尼龙线作为栓子，参照张忱等〔2〕报道的方法通过大鼠右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)法制备脑缺血/再灌注模型。再灌注组则在脑缺血后1 h，拔出栓线实现再灌注。

1.2.2模型成功标准参考Kuluz等〔3〕神经缺陷三级评分标准，脑缺血组于脑缺血后1 h评分达2级以上视为脑缺血模型成功；再灌注组于脑缺血后1 h符合以上标准，且拔栓线后动物成活2 h以上，颅底无出血，Willis环内无血栓形成，视为再灌注成功标准〔4〕。

1.2.3标本采集及处理各组动物于各时点予麻醉后处死，迅速剖腹于下腔静脉取血，剖胸取心脏组织和开颅取脑组织。

1.2.3.1取血测CK-MB浓度取血2 ml，在3 000 r/min离心10 min，取血清标本50 μl稀释5倍后用自动生化仪采用酶联速率法测定血清肌酸激酶-同工酶(CK-MB)浓度。

1.2.3.2取心脏行病理检查剖胸取出心脏后迅速用冰盐水冲洗，取左心室沿冠状面中点分成两部分，取前部分用10%甲醛溶液浸泡，石蜡包埋固定，切片常规HE染色，光镜下观察心肌病理变化。

1.2.3.3取心肌测ET-1、CGRP含量取上述后部分心肌吸去血迹称质量，尽快放入生理盐水1 ml中研磨匀浆，4℃3 000 r/min离心15 min，取上清液以5倍磷酸缓冲液(PBS)稀释。用放射免疫分析法检测ET-1、CGRP含量。

1.2.3.4取脑TTC染色和测量开颅取脑后，冠状位视交叉处起切下一厚约2 mm的脑片，置于10%TTC溶液中避光、37℃恒温30 min后，肉眼观察并数码标化摄像。经Photoshop软件处理后用Scion Image图像软件测量脑缺血面积与同侧脑面积的比率。

1.3统计学方法采用t检验、方差分析、相关分析(α=0.05)。

2　结　果

2.1各组血清CK-MB浓度变化脑缺血组血清CK-MB浓度在6 h开始升高，12 h达高峰，而后逐渐下降，再灌注组CK-MB变化规律与脑缺血组类同。再灌注组CK-MB在6 h、12 h均较脑缺血组的明显升高(P<0.05)。假手术组CK-MB在各时点比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2各组心肌 ET-1 、CGRP含量的变化脑缺血组、再灌注组心肌ET-1含量均在6 h开始升高，12 h达峰值，而后逐渐下降。脑缺血组、再灌注组心肌CGRP含量均在6 h开始降低，12 h达最低值，而后逐渐回升。脑缺血组、再灌注组ET-1/CGRP均在6 h开始升高，12 h达峰值，之后逐渐下降，在72 h仍明显高于0 h(P<0.05)。假手术组心肌ET-1、CGRP含量、ET-1/CGRP在各时点比较均无差异性(P>0.05)。见表2。

表1　各组大鼠血CK-MB 浓度的变化

与脑缺血组同时点比较：1)P<0.05，表3同

表2　各组大鼠心肌 ET-1 、CGRP含量的变化

与脑缺血组同时点比较：1)P<0.05；与假手术组同时点比较：2)P<0.05

2.3各组脑坏死组织与同侧冠状面积之比的变化脑缺血组脑坏死面积与同侧冠状面积之比随时间延长逐增大，至12 h达高峰，之后有逐渐下降；再灌注组脑坏死面积比在12 h达峰值，随后逐渐下降，且在24、48、72 h较脑缺血组脑坏死面积明显减少(P<0.05)。 假手术组未见脑坏死组织，见表3。

2.4脑缺血组与再灌注组的心肌病理改变光镜下心肌细胞：脑缺血后6 h开始出现纤维排列不规则，参差不齐，有显著的嗜伊红带，而后大部分心肌可见炎性细胞浸润、心内膜炎，部分可见肌纤维变性、灶性坏死等病理改变，偶见大面积心肌坏死。再灌注组在6 h、12 h各病理表现均有较脑缺血组发生率增高的趋势，但均无明显差异性。脑缺血组继发心肌损伤的总发生率为77.5%，再灌注组的为80%，两组间总的心肌病理异常发生率无明显差异性(P>0.05)。

表3　各组大鼠脑坏死面积占同侧冠状面积的比率

2.5心肌中CK-MB与ET-1/CGRP的相关性对所有样本心肌中CK-MB与ET-1/CGRP进行相关性分析，结果显示两者在α=0.05水平相关(r=0.547 7，P<0.05)。

3　讨　论

本研究结果说明脑缺血再灌注可减少脑缺血坏死的面积，对缺血的脑组织有保护作用，早期再灌注治疗缺血性脑卒中有积极意义。

本研究中，脑缺血后血CK-MB浓度逐渐升高，于12 h达峰值，其后逐渐下降，同时心肌病理显示心肌有炎性细胞浸润、心内膜炎、肌纤维变性、灶性坏死等心肌损伤的病理改变。根据血CK-MB升高及心肌阳性病理改变说明大鼠脑缺血后继发有心肌损伤。本实验中脑缺血继发心肌损伤的发生率为77.5%，可见MCAO易继发心肌损伤，其发生率较高。本研究提示，脑缺血再灌注后使继发的心肌损伤较单纯脑缺血所继发者加剧，这是临床上脑缺血再灌注治疗中不可忽视的问题。

ET和CGRP是一对血管舒缩功能调控作用完全相反的神经多肽，二者的动态平衡对维持心血管系统的正常生理功能具有极重要作用。ET中以ET-1作用最强，ET-1是强有力的内源性血管收缩肽，对动脉有强烈的收缩作用，且以冠脉最为敏感〔5〕，故ET-1对心脏氧供以负性作用为主。CGRP是一种由降钙素基因表达的含37个氨基酸残基的生物活性多肽，是迄今发现的体内最强的舒血管神经肽，广泛分布于神经和心血管系统，对全身血管有不同程度的扩张作用，尤对脑、心血管的作用更为显著，并有拮抗ET的作用〔6〕。

本研究提示脑缺血后心肌ET-1产生增多，心肌CGRP产生减少，ET-1、CGRP参与脑缺血后继发心肌损伤的过程。急性脑缺血可作为一种应急原而引起机体产生全身性应激反应，心血管系统是应激反应的主要效应器官，其应激反应主要由交感-肾上腺髓质系统介导。脑缺血后心肌ET-1升高机制可能与脑缺血后出现全身应激反应、心脏血管内皮细胞受损、高浓度的茶碱对ET-1诱导作用等有关〔7〕。升高的心肌 ET-1与心肌细胞上的ETA 受体结合亲和力强，使心肌细胞钙超负荷，引起钙介导的血管平滑肌和心肌收缩，抑制心肌能量代谢，促进血管活性物质释放等，从而导致心肌损伤，使血中CK-MB升高。脑缺血后CGRP也应相应增加以拮抗ET的作用，但由于CGRP降解速度快，加之ET过度增加从而导致CGRP降低。研究表明，用CGRP灌注离体大鼠缺血心脏可明显减轻心肌细胞损伤；CGRP可拮抗内皮素作用，抑制钙内流，减轻心肌损伤〔8〕。脑缺血后心肌ET-1含量增高，CGRP含量降低造成以ET-1占优势的ET-1与CGRP的平衡失调，CGRP对心肌组织保护作用减弱，ET-1对心肌负性作用增强，引起冠脉收缩和心肌低灌注状态，从而引起心肌损伤。

本研究结果提示脑缺血再灌注后使继发的心肌损伤较单纯脑缺血所继发者加剧，故考虑再灌后心肌损伤加重与心肌ET-1合成释放明显增多、CGRP明显减少、ET-1/CGRP比例明显失调有关。再灌后应激反应加剧、自由基增多、钙超载、炎症细胞激活、血管内皮细胞损害加重等可引起心肌ET-1合成释放明显增多、CGRP明显减少。心肌中高浓度的ET-1通过使冠脉强烈收缩、对心脏组织直接毒性作用等作用来加剧对心肌的损伤。心肌CGRP明显减少，其对心肌组织的保护作用明显减弱，因而心肌损伤愈发严重。

本研究显示在大鼠脑缺血后，血清CK-MB的动态变化与心肌ET-1的变化相一致，心肌ET-1和心肌CGRP变化呈相反趋势，心肌中CK-MB与ET-1/CGRP有显著性相关。这结果进一步表明，脑缺血后继发心肌损伤的严重程度与心肌ET-1升高程度、CGRP下降程度有关，脑缺血后心肌 ET-1 和 CGRP在心肌损伤中作用是相反的。

脑缺血后可继发心肌损伤，脑缺血再灌注后使继发的心肌损伤加剧，这是临床上脑缺血治疗中不可忽视的问题。本研究为脑缺血后再灌注继发心肌缺血损伤机制提供了相关的理论依据，提示在脑缺血后及时调节体内ET-1与CGRP水平，降低心肌ET-1含量，同时提高CGRP合成以调节两者平衡，可降低脑缺血/再灌注后继发心肌损伤，尚需临床上进一步试验证实。

1巩固，袁利邦，黄怡，等.LRG在脂多糖预处理诱导大鼠脑保护效应中的作用研究〔J〕.实用医学杂志，2012；28(2)：187-9.

2张忱，李刚，徐亚萍，等.大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的再灌注时间窗〔J〕.中日友好医院学报，2000；4(5)：256-8.

3Kuluz JW，Prado RJ，Dletrich D，etal.The effect of nitric oxide synthase on infarct volume after reversible focal ischemia in conscious rats〔J〕.Stroke，1993；24：2023.

4Zarow GJ，Karibe H，Staes BA，etal.Endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in rats：effect of suture insertion distance on cerebral blood flow infarct distribution and infarct volume〔J〕.Neruol Res，1997；19(3)：409-16.

5Greenberg DA，Chan J，Sampson HA.Endothelins and the nervous system〔J〕.Neurology，1992；42(1)：25-7，42-5.

6Keith IM，Tjen-A-Looic S，Kraiczi H，etal.Three-week neonatal hypoxia reduces blood CGRP and cause persistent pulmonary hypretension rats〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000；279(4)：1571-8.

7余维华，孙善全，汪克建，等.脑外伤后大鼠脊髓内去甲肾上腺素能神经元变化的研究〔J〕.中国危重病急救医学，2007；19(6)：349-52.

8万小华，谭道全.缺氧时大鼠降钙素基因相关肽含量变化与心肌损伤关系探讨〔J〕.江西医学院学报，2003；43(2)：44.

〔2014-09-17修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

符少萍(1971-)，女，主治医师，硕士，主要从事老年疾病防治研究。

R743

A

1005-9202(2016)15-3657-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.021

1中山大学孙逸仙纪念医院急诊科