抵抗素对HepG2肝细胞胰岛素信号通路IRS-2/Akt的影响

罗招凡　李芳萍　程　桦

(中山大学孙逸仙纪念医院检验科，广东　广州　510120)



抵抗素对HepG2肝细胞胰岛素信号通路IRS-2/Akt的影响

罗招凡李芳萍1程桦1

(中山大学孙逸仙纪念医院检验科，广东广州510120)

目的探讨抵抗素对HepG2肝细胞中胰岛素信号通路IRS-2/Akt的影响及其与腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路之间的关系。方法50 ng/ml重组人抵抗素处理肝HepG2细胞株，siRNA技术抑制HepG2细胞AMPK α2亚基表达，采用实时RT-PCR技术检测胰岛素信号通路相关细胞信号抑制因子3(SOCS-3)和胰岛素受体底物2(IRS-2)mRNA的水平，采用蛋白印迹技术检测蛋白激酶B(Akt)的蛋白含量及磷酸化水平。结果在基础及胰岛素刺激状态下，抵抗素上调SOCS-3 mRNA的表达(P<0.05)，下调IRS-2 mRNA的表达(P<0.05)，仅在胰岛素刺激状态下降低Akt总蛋白含量及其磷酸化水平(P<0.05)，且未转染与转染AMPKα2 siRNA组比较，Akt总蛋白含量及其磷酸化水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论抵抗素对HepG2细胞胰岛素信号通路IRS-2/Akt起抑制作用，这可能是其导致肝脏胰岛素抵抗的机制之一；抵抗素对IRS-2/Akt信号通路与AMPK通路的影响可以相互独立。

抵抗素；胰岛素抵抗；蛋白激酶B；HepG2细胞

抵抗素(Resistin)是一种富含半胱氨酸的蛋白质，属于抵抗素样分子(RELMs)，又称FIZZs(found in inflammatory zone)家族成员，在啮齿类动物中它是一种脂肪分泌因子〔1〕，曾被认为是联系肥胖和糖尿病之间的纽带〔2〕。体试验表明，输注抵抗素后能极显著增加肝糖输出及损伤肝脏胰岛素作用，其主要机制是通过抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化上调肝糖异生关键酶G6Pase、PEPCK的表达。然而，抵抗素在人类的病理作用还存在争议〔3，4〕，因为人抵抗素同小鼠的抵抗素在氨基酸水平上只有59%的同源性，而且其来源也不尽相同，人抵抗素主要来源于单核细胞。肝脏胰岛素抵抗(IR)被认为是导致2型糖尿病(T2DM)的重要原因〔5〕。其分子机制是胰岛素信号通路异常改变〔6〕。胰岛素信号通路包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，其中PI3K/蛋白激酶B(Akt)通路是主要的胰岛素信号通路，调节着体内的糖脂代谢。基于此，本课题拟研究人抵抗素是否对HepG2肝细胞PI3K/Akt通路产生影响，并探讨其与AMPK通路之间的关系。

1　材料与方法

1.1材料及主要试剂抵抗素 (美国Phoenix.Inc)；胰岛素(Humulin，40 IU/ml)(Lily公司)；AMPK α2 siRNA及CY3荧光标记对照siRNA、siPORTNeoFX转染试剂盒(美国Ambion公司)；DMEM培养基及胎牛血清 (美国Gibco公司)；兔抗磷酸化AMPK α(Thr172)抗体、Akt及磷酸化Akt(Ser473)(美国Cell Signaling公司)；SYBR GreenⅠPCR 通用混合试剂(美国Applied Biosystems公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组干预人肝HepG2细胞株来源于中山大学实验动物中心。HepG2细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养液培养，消化传代，取对数生长期细胞进行实验。按1×105个/孔的密度接种细胞于培养板，经AMPK α2 siRNA(res50+ siRNA group)、阴性对照siRNA(res50+ con siRNA group)转染24 h的HepG2细胞用含50 ng/ml抵抗素的低糖DMEM培养液处理24 h，同时未转染的HepG2细胞在相同条件下用无(res0 group)或50 ng/ml抵抗素(res50 group)处理24 h，之后用去血清的无糖DMEM培养液(仍含对应浓度的抵抗素)饥饿3～5 h，最后用无或含100 nmol/L胰岛素的低糖DMEM培养液处理2 h后收集细胞。

1.2.2siRNA序列合成及转染根据GenBank AMPK α2基因已知序列(Accession No.NM-006252)，已确证的AMPK α2 siRNA(Silencer®Validated siRNA)由Ambion公司提供，AMPK α2 siRNA正义链：5′-GGUUUCUUAAAAACAGCUGtt-3′，并采用CY3荧光标记的阴性对照siRNA(siRNA control) 监测转染效率，用转染试剂处理组作为空转对照组(mock组)。

1.2.3RNA的提取及实时定量RT-PCR检测mRNA水平用TRIZOL分离提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，用SYBR GreenⅠ实时定量PCR进行扩增，扩增条件为95℃变性10 min，然后95℃15 s，60℃1 min，共40个循环。在PCR反应结束后采用溶解曲线方法验证反应的特异性。实验结果以管家基因18 sRNA的循环阈值(Ct)作标准化，称为ΔCt，最终各基因的表达结果为2-ΔΔCT，其中-ΔΔCT 等于处理组ΔCt减去对照组ΔCT，对照组2-ΔΔCT值为1。各基因引物用Primer Express2.0软件设计，其特异性及有效性在实验前均被证实。各正义及反义引物序列见表1。

表1　实时定量PCR引物

1.2.4Western印迹检测总Akt、AMPK及Akt磷酸化蛋白表达收集6孔板细胞，加200 μl的裂解液，按Western印迹操作流程进行检测，用Image-Quant分析软件测定结果中条带灰度值，以目的蛋白与β-actin 条带灰度值的比值表示各组蛋白的相对表达量。

2　结　果

2.1AMPK α2 siRNA对AMPK α2 mRNA和蛋白表达的影响转染24 h后，AMPK α2 mRNA表达抑制率为(52.3±0.8)%，转染72 h后AMPK α2蛋白表达抑制率为(48.1±2.3)%。

2.2抵抗素在基础及胰岛素刺激状态下对HepG2细胞胰岛素信号通路相关基因mRNA表达的影响与res0组比较，在基础及胰岛素刺激状态下，抵抗素增加SOSC-3 mRNA的表达(P<0.05)，降低IRS-2 mRNA的表达(P<0.05)；单独抵抗素处理组(res50 group)与转染AMPK α2 siRNA的抵抗素处理组(res50+siRNA group)比较，IRS-2和SOSC-3 mRNA的表达差异无统计学意义，见表2。

表2　抵抗素在基础及胰岛素刺激状态下对HepG2细胞胰岛素信号通路相关基因mRNA相对表达量的影响±s)

与res0组比较：1)P<0.05；与基础状态下对应组比较：2)P<0.05

2.3抵抗素在基础及胰岛素刺激状态下对HepG2细胞AMPK及Akt蛋白及磷酸化水平的影响与res0组比较，在基础及胰岛素刺激状态下抵抗素降低AMPK的磷酸化水平(P<0.05)，仅在胰岛素刺激状态下降低Akt总的蛋白含量及其磷酸化水平(P<0.05);单独抵抗素处理组(res50 group)与转染AMPK α2 siRNA的抵抗素处理组(res50+siRNA group)比较，Akt总蛋白含量及其磷酸化水平无统计学差异，而AMPK的磷酸化水平有统计学差异(P<0.05)，见图1，表3。

表3　在基础及胰岛素刺激状态下抵抗素对HepG2细胞AMPKα(Thr172)、Akt蛋白及Akt (Ser473)磷酸化水平的影响

与res0组比较：1)P<0.05，与res50组比较：2)P<0.05，与res50+control siRNA组比较：3)P<0.05；与基础状态下对应组比较：4)P<0.05

图1　抵抗素在基础及胰岛素刺激状态下对HepG2细胞AMPK磷酸化及Akt蛋白总量及磷酸化水平的影响

3　讨　论

丝/苏氨酸激酶(Akt)主要负责由PI3K始动的生物信息的传导，Akt处于这一通路的中心环节，它在细胞代谢、细胞周期调控、细胞生长凋亡等多种生物学过程中发挥着重要作用，与IR的发生发展密切相关。以往对抵抗素的研究发现，抵抗素可能通过抑制PI3K/Akt通路导致IR〔7〕，另也有报道胰岛素信号级联途径的Akt并不受抵抗素的影响〔8〕，因此各家报道并不一致。本研究主要观察抵抗素对HepG2细胞胰岛素IRS-2/PI3K/Akt信号通路的影响，结果发现人抵抗素在胰岛素刺激条件下可下调IRS-2 mRNA的表达、减低Akt的蛋白量及其磷酸化水平，抵抗素这一抑制作用可能与其导致肝脏IR的机制有关。

SOCS家族是近年发现含有肉瘤同源区段2(SH2)结构域的蛋白质家族，现共发现8个SOCS家族成员(CIS，SOCS-1～SOCS-7)，广泛分布于胸腺、脑、心脏、骨骼肌、肝脏等组织器官，其中SOCS-3主要参与负调控细胞因子及一些激素诱导的细胞信号转导。2005年Steppan等〔9〕首先发现抵抗素可诱导3T3-L1脂肪细胞SOCS-3表达增加，而后者可与胰岛素受体竞争性结合。随后Zhou等〔7〕也报道人抵抗素可刺激L-02肝细胞SOCS-3 mRNA的表达而阻止胰岛素信号通路，Qi等〔10〕则报道抵抗素基因敲除鼠SOCS-3水平降低，导致肌肉Akt磷酸化水平上升，使胰岛素敏感性增强。

IRS-2是胰岛素受体信号耦联的重要转导蛋白，胰岛素与受体结合后，激活IRS分子，募集含SH2结构域的多种分子并与它们结合，通过这些分子向多个方向进一步传递胰岛素信号。细胞IRS表达水平的高低是胰岛素信号转导正常与否的基础，当IRS的浓度下降到一定程度，胰岛素信号的胞内转导就会受到阻滞。资料表明，肝细胞中IRS-2在维持糖代谢平衡及IRS-2缺陷对T2DM发生发展比IRS-1更重要〔11〕。

本实验表明，HepG2细胞与人抵抗素慢性孵育24 h后，在基础及胰岛素刺激状态下，人抵抗素作为细胞因子可上调HepG2细胞SOSC-3 mRNA的表达、下调IRS-2 mRNA的表达，仅在胰岛素刺激状态下减低Akt总蛋白含量及其Ser473磷酸化水平。推测抵抗素使表达上调的SOCS-3的SH2结构域竞争性结合胰岛素受体，抑制了IRS-2的表达，而IRS-2的下调可使胰岛素信号传导减弱，导致了胰岛素生物效应降低，从而诱发肝细胞IR。以上结果与Zhou等〔12〕报道结果相似。

目前对AMPK通路与Akt通路之间的关系尚存在争议。在3T3-L1脂肪细胞中，AMPK可以增加葡萄糖转运以及GLUT-4的转位，该作用与胰岛素信号通路不尽相同，研究提示AMPK可能是通过远离Akt作用位点的胰岛素信号通路，或者是一条非胰岛素激活的信号通路〔13〕。但另有研究表明，在C2C12肌细胞中AMPK可使胰岛素信号级联途径的上游组分IRS-1磷酸化，表明AMPK是胰岛素信号通路上游潜在的调节子〔14〕。出现以上不同的结果可能是由于研究细胞特性不同、所处环境不同、采用的实验条件及方法不同等。

在本研究中，我们发现在胰岛素刺激状态下，HepG2细胞单独抵抗素组与AMPK α2 siRNA转染后的抵抗素处理组SOSC-3和IRS-2 mRNA的表达、Akt的蛋白量及其磷酸化水平并无显著差异，说明人抵抗素可以影响HepG2细胞胰岛素信号通路，但这一影响并不依赖于AMPK。以上结果提示，人抵抗素对HepG2细胞AMPK通路与胰岛素PI3K/Akt通路的影响可以相互独立，但两条通路之间的关系极为复杂，有待进一步探讨。

1Holcomb IN，Kabakoff RC，Chan B，etal.FIZZ1，anovel cysteine rich secreted protein associated with pulmonary inflammation，defines a new gene family〔J〕.Embo J，2000；19(15)：4046-55.

2Steppan CM，Bailey ST，Bhat S，etal.The hormone resistin links obesity to diabetes〔J〕.Nature，2001；409(6818)：307-12.

3Lee JH，Chan JL，Yiannakouris N，etal.Circulating resistin levels are not associated with obesity or insulin resistance in humans and are not regulated by fasting or leptin administration：cross-sectional and interventional studies in normal，insulin-resistant，and diabetic subjects〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2003；88(10)：4848-56.

4Cantley J.The control of insulin secretion by adipokines：current evidence for adipocyte-beta cell endocrine signalling in metabolic homeostasis〔J〕.Mamm Genome,2014；25(9-10)：442-54.

5Kim SP，EllmererM，van Citters GW，etal.Primacy of hepatic insulin resistance in the development of the metabolic syndrome induced by and isocaloric moderate-fat diet in the dog〔J〕.Diabetes，2003；52(10)：2453-60.

6Pessin JE，Saltiel AR.Signaling pathways insulin action：molecular targets of insulin resistance〔J〕.J Clin Invest，2000；106(1)：165-69.

7Zhou L，Li L，Xia T，etal.Resistin overexpression impaired glucose tolerance in hepatocytes〔J〕.Eur Cytokine Netw，2006；17(2)：189-95.

8Moon B，Kwan JJ，Duddy N，etal.Resistin inhibits glucose uptake in L6 cells independently of changes in insulin signaling and GLUT4 translocation〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab，2003；285(1)：E106-15.

9Steppan CM，Wang J，Whiteman EL，etal.Activation of SOCS-3 by resistin〔J〕.Mol Cell Biol，2005；25(4)：1569-75.

10Qi Y，Nie ZY，Lee YS，etal.Loss of resistin improves glucose homeostasis in leptin deficiency〔J〕.Diatetes，2006；55(11)：3083-90.

11Rother KI，Imai Y，Caruso M，etal.Evidence that IRS-2 phosphorylation is required for insulin action in hepatocytes〔J〕.J Biol Chem，1998；273(28)：17491-97.

12Zhou L，Sell H，Eckardt K，etal.Conditioned medium obtained from in vitro differentiated adipocytes and resistin induce insulin resistance in human hepatocytes〔J〕.FEBS Lett,2007；581(22)：4303-8.

13Yamaguchi S，Katahira H，Ozawa S，etal.Activators of AMP-activated protein kinase enhance GLUT4 translocation and its glucose transport activity in 3T3L1 adipocytes〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab，2005；289(4)：E643-9.

14Jakobsen SN，Hardie DG，Morrice N，etal.5'-AMP-activated protein kinase phosphorylatesIRS-1 on Ser-789 in mouse C2C12 myotubes in response to 5-aminoimidazole-4-carboxamideriboside〔J〕.J Biol Chem,2001；276(50)：46912-6.

〔2015-12-03修回〕

(编辑李相军)

国家自然科学基金资助项目(30570886)；教育部留学回国人员科研启动基金资助项目(教外司留〔2015〕1098号)

罗招凡(1972-)，女，医学博士，副主任技师，主要从事代谢综合征与肿瘤的基础研究。

R589

A

1005-9202(2016)15-3629-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.008

1中山大学孙逸仙纪念医院内分泌科