饲料中抗球虫药物——沙咪珠利的高效液相色谱内标检测法研究

赵娟，张可煜，薛飞群，程培培，赖鑫淼，张丽芳

（中国农业科学院上海兽医研究所，农业部动物寄生虫病学重点开放实验室，中国农业科学院兽药安全评价与兽药残留研究重点开放实验室，上海闵行200241）



饲料中抗球虫药物
——沙咪珠利的高效液相色谱内标检测法研究

赵娟，张可煜，薛飞群，程培培，赖鑫淼，张丽芳*

（中国农业科学院上海兽医研究所，农业部动物寄生虫病学重点开放实验室，中国农业科学院兽药安全评价与兽药残留研究重点开放实验室，上海闵行200241）

本实验建立了测定饲料中抗球虫新药沙咪珠利含量的高效液相色谱（HPLC）-内标法。以4-硝基邻甲酚为内标物，C18（4.6 nm×250 nm，5 μm）柱为分析柱，乙腈-0.2%磷酸水溶液（V/V，40∶60）为流动相。饲料样品经乙腈提取，正己烷除脂，C18柱分离后，在251 nm波长下进行检测，内标法定量。结果表明，在所选择的色谱条件下，空白饲料对沙咪珠利无干扰，沙咪珠利和内标也得到良好的分离；沙咪珠利在1～50 mg/kg添加范围内具有很好的线性关系，定量限为1 mg/kg；此方法日内和日间精密度良好，日内RSD为0.57%～2.17%，日间RSD为0.32%～1.25%。相对回收率为99.43%～102.6%。本法样品前处理简单，方法简便可靠，可用于饲料中沙咪珠利的检测。

沙咪珠利；高效液相色谱；内标法；饲料；检测

艾美耳属球虫寄生于鸡的盲肠中会导致鸡球虫病的发生。鸡球虫病以流行范围广、防治困难、死亡率高为特征（Shirley等，2004）。三嗪类化合物沙咪珠利是中国农业科学院上海兽医研究所动物药学实验室自主研发的新型抗球虫药。该药物具有独特的化学结构，在前期实验中发现，5 mg/kg剂量添加到饲料或饮用水中就具有良好的抗球虫效果，9 mg/kg以上剂量添加在饲料或饮用水中能稳定地达到高效抗球虫的效果，抗球虫指数（ACI）达185～200，可用于预防或治疗球虫病，是一种高效的候选抗球虫药物（张可煜等，2014）。在预防用药的给药途径中，饲料预混给药是一种简单快捷、普遍使用的给药方式，同时在药物的安全性评价的实验中也是经常采用的方法。为了能准确检测沙咪珠利在饲料中的含量，本实验研究建立了高效液相色谱（HPLC）内标法测定饲料中沙咪珠利。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂Waters 2690高效液相色谱仪（美国沃特世公司生产）；Waters 2487紫外检测器（美国沃特世公司生产）；Micro CL 17/21离心机（美国Thermo公司）；超纯水系统（上海瑞枫生物科技有限公司）；涡旋混合器（XW-OA，上海医科大学仪器厂）；氮吹仪（美国Organomation Associates公司）；AE240双量程分析天平［（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）］；离心机（AnkeLXJ-ⅡB，上海安亭科学仪器厂）。

沙咪珠利对照品（含量≥99.5%，中国农业科学院上海兽医研究所动物药学研究室制备）；4-硝基邻甲酚（含量：99.25%，中国农业科学院上海兽医研究所动物药学研究室制备）；正己烷（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Fisher Chemical）；磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；所用水均为UP水。

1.2溶液的配制

1.2.1沙咪珠利标准液配制精密称取50 mg沙咪珠利标准品于25 mL容量瓶中，用乙腈溶解配成2 mg/mL的标准储备液，取适量用乙腈分别稀释成1000、600、400、200、100、20 μg/mL系列浓度溶液，于4℃保存。

1.2.2内标标准液配制精密称取4-硝基邻甲酚150.0 mg于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配成3 mg/mL的标准液。于冰箱4℃下保存。

1.3样品的前处理将大鼠饲料进行研磨后，称取（2.00±0.02）g饲料于50 mL具塞离心管中，加入浓度为3 mg/mL的4-硝基邻甲酚100 μL作为内标，涡旋30 s，混匀。加入10 mL乙腈涡旋1 min，超声30 min，4000 r/min离心10 min，取上清液乙腈层5 mL置于小试管中，于50℃水浴下氮气吹干。加1 mL乙腈-0.2%磷酸水混合液（V/V，40∶60）复溶后，再加入1 mL正己烷，涡旋30 s，弃去上层正己烷层，取下层液体于14000 r/min离心10 min，经0.22 μm微孔滤膜过滤，上高效液相色谱仪测定。

1.4色谱条件及方法学验证

1.4.1色谱条件色谱柱：Unitary C18（4.6 nm× 250 nm，5 μm）；流动相：乙腈（A%）和0.2%磷酸水溶液（B%）进行梯度洗脱（表1）。检测波长251 nm，柱温30℃，流速1 mL/min。

表1　梯度洗脱程序

1.4.2方法特异性取空白大鼠饲料以及空白大鼠饲料加标样品分别按1.3的方法处理，在上述HPLC条件下进行测定，并同时测定沙咪珠利标准品溶液，记录色谱图。

1.4.3定量限和检测限的确定取沙咪珠利标准储备液，在室温下分别稀释成不同浓度的标准工作溶液，然后各取100 μL添加到空白饲料中。充分混合后按照1.3的样品处理方法进行前处理，随后进行HPLC测定和色谱图记录。以HPLC检测获得的目标峰峰高信噪比不低于10倍（S/N≥10）时所对应的溶液浓度为该方法的定量限浓度，以检测出的目标峰峰高信噪比不低于3倍（S/N≥3）时所对应的溶液浓度为该方法的检测限浓度。

1.4.4线性关系取100 μL浓度为1000、600、400、200、100、20μg/mL沙咪珠利系列浓度溶液分别加入2.00 g空白饲料中，按照1.3的样品处理方法进行前处理后，再进行HPLC测定，根据沙咪珠利的峰面积与内标物4-硝基邻甲酚峰面积的比值和标准溶液的浓度进行线性回归处理，确定其回归方程、相关系数以及线性范围。

1.4.5精密度和回收率测定向2.00 g空白饲料中分别添加高、中、低三个添加浓度（900、400、30μg/mL）沙咪珠利标准溶液各100 μL，使沙咪珠利在饲料中的浓度分别为45、20、1.5 mg/kg，并均添加浓度为3 mg/mL的4-硝基邻甲酚100 μg/mL作为内标，按照1.3的样品处理方法进行前处理，随后进行HPLC测定，每个浓度做5个平行，计算沙咪珠利在饲料中的回收率以及日内变异系数。并且采用相同的方法连续检测3 d，计算沙咪珠利的日间变异系数。

1.4.6储备液稳定性测定本研究对沙咪珠利和内标物4-硝基邻甲酚的储备液进行了稳定性考察。将沙咪珠利和内标物的储备液用乙腈稀释制备成浓度分别为33.2 μg/mL和249 μg/mL工作溶液，经高效液相色谱测定，平行测定两次，分别记录沙咪珠利和内标物4-硝基邻甲酚的峰面积。储备液分别放置7 d和14 d后，再稀释成同一浓度的工作溶液进行测定。

1.4.7样品检测将大鼠饲料样品进行抽测。每份样品抽取三份饲料，称取2.00 g饲料，按照1.3的方法处理后进行测定。

2　结果与分析

2.1内标物选择为保证试验结果的准确性，消除样品提取过程中产生及机器运行状态不同所造成的误差，因此采用内标法。内标法要选择合适的内标物，内标物出峰时间与被测组分出峰时间应接近且能完全分离。本研究尝试采用妥曲珠利亚砜为内标（林析，2015），结果显示，沙咪珠利与妥曲珠利亚砜的出峰时间相差较远，所以弃用。之后选择4-硝基邻甲酚进行尝试，在所选色谱条件下，两者出峰时间接近，且无干扰，峰型良好且稳定。所以选择4-硝基邻甲酚作为内标。

2.2色谱条件的选择沙咪珠利是三嗪类化合物，从沙咪珠利的化学结构上分析，采用C18反相柱进行分离，在紫外波长251 nm下进行检测（王昊欣，2014）。使用乙腈、纯水、磷酸作流动相，考察不同比例对沙咪珠利内标和饲料中杂质的分离效果。实验结果表明采用乙腈-纯水系统出现主峰拖尾的现象，采用乙腈-水-磷酸体系能实现主成分和各杂质的良好分离

2.3样品的前处理饲料中油脂成分较多，本研究尝试过用PSA固体萃取法萃取（江兆玲，2014），发现PSA对沙咪珠利具有吸附性，故弃用；后采用液液萃取的方法，用正己烷萃取油脂，进行净化。

在样品的复溶中，发现用甲醇复溶有乳化现象出现，所以用乙腈复溶（肖文龙，2014），且未出现乳化现象。

2.4方法特异性空白大鼠饲料，沙咪珠利和内标物4-硝基邻甲酚标准品溶液及空白饲料加标样品色谱图，如图1所示。数据结果表明本方法对饲料中的沙咪珠利和内标4-硝基邻甲酚分离效果良好，沙咪珠利出峰时间为6.35 min，内标物4-硝基邻甲酚出峰时间为8.21 min，无杂质干扰，特异性良好。

图1　沙咪珠利在的HPLC检测条件下色谱图

2.5灵敏度与线性关系由实验结果可知，沙咪珠利在饲料中的峰高为10倍和3倍基线噪音的最小浓度分别为1 mg/kg和0.5 mg/kg饲料。沙咪珠利在饲料中的检测限为1 mg/kg，定量限为0.5 mg/kg。

以沙咪珠利工作液的浓度为横坐标，沙咪珠利和4-硝基邻甲酚的峰面积比值为纵坐标进行线性回归处理。结果见图2。由图2可知，沙咪珠利在20～1000 μg/kg的添加浓度范围内，具有良好的线性关系，线性方程为Y=0.0025X-0.0125，R2＞0.999。

图2　沙咪珠利在饲料中的标准曲线

2.6精密度和回收率在大鼠饲料中添加高、中、低（900、400、30 μg/kg）三个浓度的沙咪珠利工作液，每个浓度平行测定5个样品，连续测定3批的回收率及精密度结果见表2。从结果可以看出，沙咪珠利的平均加标回收率为99.43%～102.6%，日内变异系数为0.57%～2.17%，日间变异系数为0.32%～1.25%。

2.7稳定性本研究考察了两个星期的稳定性，结果见表3。沙咪珠利和内标物4-硝基邻甲酚在两个星期内的稳定性RSD＜5.0%，稳定性良好。

2.8样品检测取添加沙咪珠利的浓度为8 mg/kg的高压鼠料，进行研磨后，称取三份平行样品，按1.3的方法进行处理，测定。检测结果显示，添加8 mg/kg沙咪珠利的药物回收率分别为82.99%、79.00%、83.63%，平均回收率为81.87%，相对标准标准偏差为2.5%。

表2　饲料中沙咪珠利的添加回收率和精密度的检测结果（n=4）

表3　沙咪珠利储备液和内标储备液稳定性

3　结论

本研究采用高效液相色谱内标法对饲料中沙咪珠利进行测定，方法采用4-硝基邻甲酚作内标，峰型好，出峰情况稳定。沙咪珠利在1～50 mg/kg添加范围内检测具有很好的线性关系，定量限为1 mg/kg；此方法日内和日间精密度良好，日内RSD为0.57%～2.17%，日间RSD为0.32%～1.25%。相对回收率为99.43%～102.6%。该方法准确度高，稳定性好，样品前处理简单，为沙咪珠利在饲料中的质量控制提供了可靠的方法。

［1］江兆玲.动物性食品中妥曲珠利及其主要代谢物妥曲珠利砜和妥曲珠利砜残留量的测定：［硕士学位论文］［D］.北京：中国农业科学院，2014.

［2］林析.新型三嗪类抗球虫药AC4的药代动力学研究：［硕士学位文论文］［D］.北京：中国农业科学院，2015.

［3］王昊欣.AC4原料药质量研究及溶液剂处方筛选：［硕士学位文论文］［D］.北京：中国农业科学院，2014.

［4］肖文龙，张可煜，吴昊，等.高效液相色谱法（HPLC）测定饲料中AC4的含量［J］.工业饲料，2014，35（3）：55～57.

［5］张可煜，李素梅，王霄旸，等.大鼠粪便中抗球虫新药沙咪珠利的HPLC检测方法研究［J］.中国动物传染病学报，2014，22（4）：45～49.

［6］Shirley M W，Ivens A，Gruber A，et al.The Eimeriagenome projects：a sequence of events［J］.Trends Parasitol，2004，20（5）：199～201.

A High Performance Liquid Chromatography（HPLC）with an internal standard was developed for determination of Acetamizuril content in feed.2-methyl-4-nitroanisole，C18 column（4.6 nm×250 nm，5 μm）and acetonitrile-0.2% phosphoric acid water solution（V/V，60∶40）were used as internal standard，analytical column and mobile phase，respectively.Feed samples were firstly extracted by acetonitrile，then undergone n-hexane grease removal，after being isolated by C18column，eventually detected by UV detector at 251 nm，and was quantified by internal standard method.The results showed that under the chosen chromatographic conditions，Acetamizuril and 2-methyl-4-nitroanisole were separated successfully；In feed，the detection of Acetamizuril content was linear in the range of 1 to 50 mg/kg and the lowest limit was 1mg/kg；the intraday and interday precision were quite excellent with intra RSD of 0.57%～2.17%and inter RSD of 0.32%～1.25%.The relative recovery was between 99.43%and 102.6%.The method was proved to be simple，rapid，precise and reproducible for quantification of Acetamizuril in feed．

Acetamizuril；HPLC；internal standard method；feed；detection

S816.17

A

1004-3314（2016）03-0032-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160308

公益性行业（农业）科研专项（201303038-1）；国家科技支撑计划（2015BAD11B01-06）