丁苯酞预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1和血脑屏障的影响

纪海茹　孔令伟　孔　维　赵淑敏　孔祥玉　陈　萌　郑小影

(承德医学院，河北　承德　067000)



丁苯酞预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1和血脑屏障的影响

纪海茹孔令伟孔维1赵淑敏1孔祥玉1陈萌1郑小影1

(承德医学院，河北承德067000)

目的探讨丁苯酞(NBP)预处理对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠基质金属蛋白酶(MMP)-9、基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1和血脑屏障的影响。方法90只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、NBP预处理组低剂量组(NBPⅠ组)、NBP预处理组中剂量组(NBPⅡ组)、NBP预处理组高剂量组(NBP Ⅲ组)，每组18只。采用线栓法制作大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，缺血2 h再灌注24 h后以干湿重法测定脑组织含水量，收集脑血管外伊文思蓝(EB)含量来评估血脑屏障的破坏程度，qPCR法检测MMP-9及TIMP-1 mRNA的表达水平。结果脑缺血再灌注后，脑组织含水量及EB含量明显增加，MMP-9和TIMP-1表达均增强，与假手术组比较有显著差异(P<0.01)。NBP预处理各组脑组织含水量及EB含量较模型组明显下降，MMP-9表达显著减少，TIMP-1表达明显增加(P<0.01)，NBPⅡ、Ⅲ组无显著差异(P>0.05)。结论NBP预处理对CIRI大鼠可通过调节MMP-9/TIMP-1的表达，降低血脑屏障通透性，减轻脑水肿，发挥预防性保护作用。

丁苯酞;预处理;脑缺血再灌注损伤;基质金属蛋白酶-9;基质金属蛋白酶组织抑制因子-1

脑缺血再灌注损伤(CIRI)后产生大量自由基、炎症因子等有害物质，使血脑屏障(BBB)通透性增加，水和血浆成分漏出到周围脑组织，最终导致血管源性脑水肿，严重时甚至可发生脑疝。颅内压增高又进一步加剧BBB的破坏和脑血管通透性增加，导致脑水肿，形成恶性循环〔1〕。因此，通过保护BBB来减轻脑水肿的程度被看作治疗CIRI的关键环节。近年研究显示〔2〕，基质金属蛋白酶(MMP)-9可降解细胞外基质、改变血管通透性，导致BBB破坏和脑水肿的发生，其在CIRI后表达显著增加。基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1是MMP-9的特异性抑制剂，二者平衡关系的失调参与了BBB的破坏。观察CIRI后二者表达水平的变化对评价药物治疗价值有重要意义〔3〕。丁苯酞(NBP)软胶囊是作用于缺血性脑卒中多个靶点、多个环节的创新药物〔4〕，对缺血性脑卒中有肯定的治疗作用，但其预防性保护作用的机制尚不明了，本研究探讨NBP对CIRI预防性保护作用及机制。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠90只，SPF级，体重260～280 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司〔许可证号：SCXK(京)2012-0001〕。大鼠经适应性饲养1 w后，随机分为假手术组、模型组、NBP预处理组低剂量组(NBPⅠ组)、NBP预处理组中剂量组(NBPⅡ组)、NBP预处理组高剂量组(NBP Ⅲ组)，每组18只。

1.2实验药品及试剂NBP软胶囊由石药集团恩必普药业有限公司提供，批号：118120711；伊文思蓝购自TCI公司，批号：W8IFA-AT；RNasio Plus购自宝生物工程有限公司，批号：AK3701；实时荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程有限公司，批号：AK8203、AK2102。

1.3实验仪器实时荧光定量PCR仪Mx3000P，美国安捷伦 Stratagene公司;3K30型冷冻离心机，德国SIGMA公司;移液器;匀浆器;显微手术器械;直径0.23 mm的鱼线;自制大鼠固定板。

1.4实验方法

1.4.1动物模型制备及处理大鼠适应性喂养1 w后，灌胃给药，NBPⅠ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别给予NBP 20、40、80 mg·kg-1·d-1，假手术组和模型组给等容积的生理盐水，共7 d。模型组及给药组采用Longa等〔5〕改良线栓法制备大鼠(MCAO)模型，假手术组仅分离右侧颈总、颈外、颈内动脉，不插入线栓。术后单笼饲养，电暖气低档保暖。缺血2 h后抽提栓线至颈外动脉残端内进行再灌注，再灌注24 h后做相应处理。

1.4.2脑组织含水量测定采用干湿重法。每组取6只大鼠麻醉后迅速取脑，去除小脑和脑干，分离出右侧大脑，用电子天平称其湿重后，置于100℃烤箱中烤干至恒重，脑组织含水量计算公式：(湿重-干重)/湿重×100%。

1.4.3BBB通透性测定采用伊文思蓝(EB)作为示踪剂监测BBB损伤程度的方法。各组取6只大鼠，再灌注23 h后，经大鼠尾静脉注入2%的EB(4 ml/kg)，大鼠球结膜、皮肤等部分变蓝表示注入成功。循环1 h后，经心脏灌注预冷的生理盐水至右心房流出清亮液体时，快速断头取脑，取缺血侧脑组织称湿重后放入5 ml甲酰胺溶液中浸泡，54℃恒温培养箱中孵育24 h，1 000 r/min离心5 min，移液器吸取其上清液200 μl用酶标仪测定其630 nm处的OD值。甲酰胺溶液做空白比色。脑组织EB含量计算公式：脑组织EB含量(μg/g)=待测样品EB含量(μg/ml)×甲酰胺容量(ml)/脑湿重(g)，待测样品EB含量根据标准曲线求得。

1.4.4实时荧光定量PCR方法检测MMP-9、TIMP-1 mRNA表达水平每组取6只大鼠，再灌注24 h后麻醉取脑，预冷的生理盐水冲洗后取缺血侧脑皮质置于无酶管中-80℃冻存。使用宝生物工程有限公司提供的RNAsio Plus提取总RNA，紫外分光光度计检验RNA纯度，要求波长在260/280 nm处吸光度比值为1.8～2.2。根据GenBank上登陆的MMP-9、TIMP-1的基因序列，以β-actin为内参照，设计合成引物。β-actin正义链：5′-CGCTGACAAGAAGTGGGGTTT-3′,反义链：5′-TACAGATGGTGGATGCCTTTTATG-3′；MMP-9正义链：5′-CCTGGTTCCCTGGCATAATC-3′；反义链：5′-CGCTCTGGTAGCCCTTCTC-3′；TIMP-1正义链：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′；反义链：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。根据Takara公司提供的实时荧光定量试剂盒采用SYBR法对MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达水平进行测定，总反应体系为25 μl，包括Premix Ex TaqⅡ 12.5 μl,cDNA 2 μl，灭菌蒸馏水8.5 μl，上下游引物各1 μl(10 μmol/L)，放入实时定量PCR反应仪，反应条件：预变性95℃ 30 s，变性95℃ 5 s，退火51℃(MMP-9)、48℃(TIMP-1) 30 s，延伸72℃ 30 s，反应循环数为40，设置熔解曲线判断是否有非特异性的扩增和引物二聚体的出现。分析方法利用2-ΔΔCt的方法。

1.5统计学处理采用SPSS17.0软件进行One-way ANOVA检验。

2　结　果

2.1NBP预处理对脑组织含水量的影响 与假手术组比较，模型组与NBP预处理各组大鼠脑组织含水量显著增加(P<0.01)；与模型组比较，NBP预处理各组大鼠脑组织含水量均显著减少(P<0.01)，NBPⅡ、Ⅲ组较NBPⅠ组减少更明显(P<0.05)，但NBPⅡ、Ⅲ组之间差异并不明显(P>0.05)。见表1。

表1　各组大鼠大脑缺血侧脑含水量、EB含量及MMP-9、TIMP-1 mRNA相对表达量的比较

与假手术组比较：1)P<0.01，与模型组比较：2)P<0.01；与NBPⅠ组比较：3)P<0.05

2.2NBP预处理对脑组织BBB通透性的影响 与假手术组比较，模型组与NBP预处理各组大鼠脑组织BBB通透性均显著增加(P<0.01)；与模型组比较，NBP各组大鼠脑组织BBB通透性均显著降低(P<0.01),NBPⅡ、Ⅲ组较NBPⅠ组降低更多(P<0.05)，但NBPⅡ、Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05)。见表1。

2.3NBP预处理对脑组织MMP-9和TIMP-1 mRNA表达的影响假手术组大鼠脑组织内有MMP-9和TIMP-1均有微量表达；模型组大鼠脑组织内MMP-9的表达与假手术组比较明显升高，TIMP-1也相应升高(P<0.01)；NBP预处理各组MMP-9表达均减少(P<0.01)，TIMP-1表达均增加(P<0.01)，其中NBPⅡ组较NBPⅠ组减少明显(P<0.05)，NBP Ⅲ组与NBPⅡ组无显著性差异(P>0.05)。见表1。

3　讨　论

近年研究显示，BBB的完整性在CIRI时发挥着举足轻重的作用〔6〕，MMP-9是BBB损伤的关键点〔7〕，其在正常组织内仅有低水平的表达，在缺血缺氧等情况下表达量大幅增加〔8，9〕，可由星形细胞、 血管内皮细胞、 小胶质细胞、神经细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等合成并分泌〔10〕，其在细胞外被激活后可水解细胞外基质，破坏BBB，致其通透性增加，引起血管源性脑水肿〔11〕。Asahi等〔12〕发现，敲除MMP-9基因的小鼠脑梗死体积明显缩小，BBB破坏程度也显著减轻。TIMP-1是MMP-9的内源性组织抑制因子,可与MMP-9特异性结合进而抑制其活性，阻断MMP-9对细胞外基质和基底膜的降解〔13〕，二者的表达变化与脑含水量变化一致，参与了血脑屏障及血管基底膜的破坏〔14〕。本实验结果显示，缺血2 h再灌注24 h后，EB含量显著增加，MMP-9表达明显增多，与文献报道一致〔15〕。

NBP可作用于脑缺血病理的多个环节，改善缺血后的多种病理变化，具有保护线粒体功能、抑制脂质过氧化、清除自由基、抑制炎症反应、恢复能量代谢、抑制血小板集聚及增加缺血区血流量等药理作用〔16〕。邵小鹏等〔17〕应用NBP治疗老年血管性痴呆取得较好疗效。

NBP预处理可能通过下调MMP-9、上调TIMP-1的表达，减轻BBB的损伤，降低脑水肿程度，进而发挥对CIRI的预防性的保护作用。提示NBP可预防性应用于缺血性脑卒中的高危人群，减轻脑损伤，为临床防治缺血性脑损伤提供了新的思路。

1Jin G,Arai K,Murata Y,etal.Protecting against cerebrovascular injury:contributions of 12/15-lipoxygenase to edema formation after transient focal ischemia〔J〕.Stroke,2008;39(9):2538-43.

2刘昱言,刘轲,刘敬霞,等.基质金属蛋白酶-2、-9与脑缺血微血管损伤的关系〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(1):257-9.

3田培超,王怀立.MMP-9及TIIMP-1在大鼠感染性脑水肿的表达和意义〔J〕.中国实用神经疾病杂志,2007;10(3):9-11.

4纪海茹,孔维,赵淑敏,等.丁苯酞对脑缺血再灌注损伤保护作用的研究进展〔J〕.承德医学院学报,2014;31(3):239-41.

5Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

6陈萌,孔维,赵淑敏,等.黄芩茎叶总黄酮预处理对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马神经元和血脑屏障形态学的影响〔J〕.解剖学杂志,2012;35(3):341-4.

7曲思凤,王佳妮,魏欣冰,等.氯沙坦对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障通透性和MMP-9表达的影响〔J〕.山东大学学报,2007;45(10):992-5.

8Wu Y,Wang YP,Guo PP,etal.A Lipoxin A4 analog ameliorates blood-brain barrier dysfunction and reduces MMP-9 expression in a rat model of focal cerebral ischemia-reperfusion injury〔J〕.J Mol Neurosci,2012;46(3): 483-91.

9Xiang J,Lan R,Tang YP,etal.Apocynum venetum leaf extract attenuates disruption of the blood-brain barrier and upregulation of matrix metalloproteinase-9/-2 in a rat model of cerebral ischemia-reperfusion injury〔J〕.Neurochem Res,2012;37(8):1820-8.

10Jimei L,Yin L,Molly O,etal.DL-3-n-butylphthalide prevents neuronal cell death after focal cerebral ischemia in mice via the JNK pathway〔J〕.Brain Res,2010;1359:216-26.

11Gong Y,Hart E,Shchurin A,etal.Inflammatory macrophage migration requires MMP- 9 activation by plasminogen in mice〔J〕.J Clin Invest,2008;118(9):3012-24.

12Asahi M,Wang X,Mori T,etal.Effects of matrix metalloproteinase 9 gene knock out on the proteolysis of blood brain barrier and white matter components after cerebral ischemia〔J〕.J Neurol Sci,2001;21(19):7724-32.

13Krizanac-Bengez L,Hossain M,Fazio V,etal.Loss of flow induces leukocyte-mediated MMP/TIMP imbalance in dynamic in vitro blood brain barrier model role of pro-inflammatory cytokines〔J〕Am J Physiol Cell Physiol,2006;291(4):C740-9.

14陈合成,杨金升,杨军,等.白藜芦醇对大鼠脑缺血基质金属蛋白酶-9及其组织抑制因子-1表达的影响〔J〕.中华老年心脑血管病杂志,2007;9(10):703-6.

15高兰，娄季宇，杨霄鹏.丁苯酞对脑缺血再灌注损伤大鼠MMP-9活性和血脑屏障通透性的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志,2012;29(2):116-8.

16李延可,刘宁,陈江君.丁苯酞对急性缺血性脑卒中的作用及机制研究〔J〕.中国医药导刊,2012;14(2):254-5.

17邵小鹏,桂树华,胡玲玲.丁苯酞治疗老年血管性痴呆的临床疗效及对精神心理量表的影响〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(22):5601-2.

〔2014-12-10修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

承德医学院2016年校级课题项目(No.201627)

赵淑敏(1954-)，女，硕士，教授，硕士生导师，主要从事超微病理学，心、脑血管缺血性损伤机制与修复研究。

纪海茹(1987-)，女，住院医师，在读硕士，主要从事药物治疗缺血性脑血管疾病研究。

R965

A

1005-9202(2016)17-4171-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.016

1承德医学院基础医学部