铁皮石斛叶斑病新病原——黑线炭疽菌的分离鉴定及致病性测定*

赵桂华，赵楠

(江苏农林职业技术学院，江苏　句容212400)



铁皮石斛叶斑病新病原
——黑线炭疽菌的分离鉴定及致病性测定*

赵桂华，赵楠

(江苏农林职业技术学院，江苏句容212400)

为了研究铁皮石斛炭疽病，在实验室和栽培地里分别对由黑线炭疽菌引起的铁皮石斛炭疽病进行了症状观察，分离培养、病原菌鉴定和致病性试验。结果表明，黑线炭疽菌仅为害叶片，平均发病率11.3%；在分离到的59个真菌菌落中，黑线炭疽菌占44.1%。经过形态学描述、DNA测序鉴定，以及致病性试验，确定黑线炭疽菌是引起铁皮石斛炭疽病的病原菌。它是铁皮石斛的新病原，在中国属于首次报道。

铁皮石斛；病原菌；鉴定；黑线炭疽菌

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)炭疽病，又被称为黑斑病、褐腐病、斑点病等，分布于中国的铁皮石斛栽培区。到目前为止，全世界记载了炭疽菌属(ColletotrichumCorda 1831)的817个种、变种和专化型。关于该属真菌的研究，Arx J A von[1～2]对炭疽菌种进行了校正，按照传统的形态分类原则，将孢子萌发后产生的附着胞作为炭疽菌的鉴别特征之一，并指出炭疽菌属是炭疽菌唯一合法的属名，而炭疽菌属又是子囊菌亚门小丛壳属(GlomerellaSpauld.& H.Schrenk 1903)的唯一分生孢子阶段。把原来的众多种类归纳分类，简化为20个形态种，9个专化型和3个型[1～4]。关于铁皮石斛炭疽病的病原菌，中国学者曾报道了胶孢炭疽菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)Penz.& Sacc.]和蝴蝶兰炭疽菌(ColletotrichumphalaenopsidisSawada)[5～7]和辣椒炭疽病[Colletotrichumcapsici(Syd.& P.Syd.)E.J.Butler & Bisby][8]；而由黑线炭疽菌(Colletotrichumdematium)引起的铁皮石斛炭疽病未见报道。

本文以人工栽培的铁皮石斛为材料，对其炭疽病的病原菌进行了分离培养、纯化与致病性测定，用形态学和DNA分子生物技术相结合的方法对病原菌进行了鉴定，以期明确该病害的病原菌，为铁皮石斛炭疽病的防治提供理论依据；并介绍黑线炭疽菌的危害症状，发病规律，并提出其具体的防治建议。

1　材料与方法

1.1分离材料来源

2014年4月-2015年6月，在江苏句容润泰生物科技有限公司铁皮石斛基地(31°50′737″N,119°10′079″E，海拔11.0m)对铁皮石斛叶斑病进行普查期间，发现了铁皮石斛炭疽病的危害，采集具有典型病状叶片标本，标号后分别装入灭菌的干燥纸袋，带回实验室进行分离培养。

1.2病原菌的分离与培养

选取病斑明显的叶片，经70%酒精棉球表面消毒3次后，待表面干燥后，取病健交界处的组织，剪成3mm×4mm小块，转移到PDA培养基上，5块/皿，共分离15皿，然后置于25±2℃的PRX-250A型智能人工气候箱培养，4d后检查分离得率；挑取单菌落边缘菌丝进行纯化，转管并保存于4℃冰箱，备用。

1.3致病性测定

2015年5月3日至5月12日对黑线炭疽菌进行致病性试验。使用纯化的黑线炭疽菌，在PDA上培养4d，其培养条件同1.2；用灭菌的打孔器将培养好的黑线炭疽菌打成菌饼，以保证接种量的一致；使用70%的酒精擦去铁皮石斛叶片表面的灰尘，再用灭菌的接种针在叶片上刺一下，造成微小的伤口，然后把菌饼(有菌丝的一面接触叶片)放在刺伤的小孔处，接种点用无菌水棉球保湿，上面用塑料薄膜覆盖。对照用无菌的PDA圆饼接种，方法相同，接种20个点。为了与自然发病的环境条件相似，把接种后的盆栽铁皮石斛直接放在大棚内进行观察。共接种20个叶片(每根茎杆上接种1个叶片)，分别在3d、6d、9d进行病状观察，同时记录发病情况。

1.4病原菌鉴定

1.4.1形态学特征

根据在PDA上的菌落培养形状，分生孢子堆的颜色，分生孢子和附着胞大小、形状、颜色进行鉴定[7]。

1.4.2分子鉴定

DNA 的提取、扩增、纯化和测序参见赵桂华(2012)[9]；测序结果通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性比对。引物合成与测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

2　结果与分析

2.1症状描述

2.1.1症状

该病害在叶上的初期症状为淡黄色，后期为黑褐色的病斑(图1)，圆形、近圆形，直径可达5.5mm。病害先从下面老叶开始，逐渐向上部蔓延，这是因为新叶的生理活性比老叶更强、更抗病；平均发病率为11.3%。在多数情况下，病斑上的同心轮纹明显；在病害发生后期，特别是在相对湿度大于90%时，在病斑上会产生灰白色的分生孢子堆，即分生孢子盘和分生孢子。但从该病害的症状上看，由黑线炭疽菌引起的炭疽病与其他炭疽菌种类引起的炭疽病有时难以区分，实际上，炭疽病就是叶斑病的一种类型。

图1　铁皮石斛的黑线炭疽病症状

2.2分离结果

在分离的75块组织中，共得到真菌菌落59个，占78.6%；细菌菌落11个，占14.7%；未长任何菌的5块，占6.7%。其中，59个真菌菌落隶属于5个属6种，即黑线炭疽菌26块，占44.1%；细极链格孢菌[Alternariatenuissima(Kunze) Wiltshire]15块，占25.4%；互隔链格孢[Alternariaalternata(Fr.) Keissl.]7块，占11.9%；芽枝状枝孢[Cladosporiumcladosporioides(Fresen.) G.A.de Vries]6块，占10.2%；黑曲霉(AspergillusnigerTiegh.)3块，占5.1%;匍枝根霉[Rhizopusstolonifer(Ehrenb.) Vuill.]2块，占3.4%。在11块细菌中，枯草芽孢杆菌[Bacillussubtilis(Ehrenberg)Cohn]7块，占63.6%；其他细菌4块，占3.6%。

2.3致病性测定结果

试验证明，从接种第3d开始，有20%的接种点出现明显的水渍状坏死症状，淡褐色，1～2mm；随后发展较快，6d发病率达95%，淡褐色至深褐色，大小2～4mm；只有1个发病较晚，是接种后不久菌饼脱落，接种量相对较少的原因；9d全部发病(表1)。对照在第9d有3个点发病，病斑仅为1～2mm，比接种病原菌产生的病斑更小，这是正常的。因为铁皮石斛大棚里本身就存在一些黑线炭疽菌，有机会感染伤口。

人工接种出现的症状与自然发病的症状基本一致，对接种产生的病斑进行再分离，得到了黑线炭疽菌，符合柯赫法则(Koch postulates)。

对照处理也有3个伤口发病，但病斑扩展速度和病斑颜色与黑线炭疽的接种病斑稍有差异，并对3个病斑分别进行了分离培养，得到的真菌菌落进行了鉴定，1个病斑为黑线炭疽，1个病斑为镰刀菌(Fusariumsp.)，1个病斑为黑曲霉。分析原因，在铁皮石斛上这3种真菌都是病原菌，产生的病斑小，扩展速度比接种的黑线炭疽菌更慢的原因是自然感染的接种量小。镰刀菌是铁皮石斛上常见的病原菌；而在铁皮石斛组培瓶中，黑曲霉是引起幼苗腐烂死亡的重要病原菌；在铁皮石斛病害分离过程中，常常分离到黑曲霉。

表1　黑线炭疽菌接种检查日期及发病率

注：第一次检查时间是5月6日，第二次检查时间是5月9日，第三次检查时间是5月12日。

2.4病原

黑线炭疽菌Colletotrichumdematium(Pers.) Grove,J.Bot.,Lond.56:341 (1918)[7,10]

有性世代：Glomerellacingulata(Stoneman) Spauld.& H.Schrenk,in Schrenk & Spaulding,Science,N.Y.17:751 (1903)

异名(Synonymy)：根据真菌索引(Index of fungorum)的记载，黑线炭疽菌的异名有7属26种12变种3个专化型，其中包括,炭疽孢属10种1变种和2个专化型，丛刺盘孢属(Vermicularia)11种、5变种和4个专化型，球果菌属(Sphaeria) 2种，刺杯毛孢(Dinemasporium)、外生孢属(Exosporium)、Lasiella属、Ellisiellina属各1种。

2.4.1分类地位和形态描述

在PDA培养基上，菌落初为白色，后渐变为灰褐色至黑褐色，气生菌丝绒毛状，分生孢子堆灰白色；日平均生长量为1.2cm；分生孢子梗分枝，浅褐色；产孢细胞近瓶梗状，无色，顶端产生分生孢子；分生孢子镰刀形，单胞，无色，顶端稍钝圆，内有多个小脂肪球(图2)，大小为22.7～27.5μm×3.6～4.8μm，平均25μm×3.9μm。

分生孢子萌发后会产生不同形状的附着胞。①在一根菌丝顶端单生，近椭圆形，基部平齐、壁厚，顶端钝圆，壁稍薄(图3)；②在一根菌丝上可产生2～3个椭圆形和棍棒状的附着胞(图4)；③在椭圆形附着胞下面有4个大小不等细胞(图5)；④有的附着胞为双细胞，基部有1个厚壁无色细胞(图6a)；⑤附着胞上有发芽缝(图6b)；⑥附着胞萌发后再产生附着胞，基部有1个深褐色细胞，菌丝无色(图6c)；⑦附着胞萌发再产生褐色至深褐色的附着胞(图6d)；大小为7.8～20.5μm×6.0～14.1μm，平均6.0μm×14.1μm。

以柯赫氏法则为基础，根据病原菌培养性状和形态特征，并参照已有的文献资料，将铁皮石斛炭疽菌的病原菌确定为隶属于半知菌亚门、腔孢纲(Coelomycetes)、黑盘孢目(Melanconiales)、黑盘孢科(Melanconiaceae)、炭疽菌属的黑线炭疽菌。

黑线炭疽菌的近似种是产弯孢的辣椒炭疽菌，葱炭疽菌[C.circinans(Berk.) Vogl]和豆类炭疽菌[C.truncatum(Sehw.) Andrus & Moore][11]。

图2　黑线炭疽菌的分生孢子形态

图3　单生的附着胞

图4　大小不等的附着胞

图5　附着胞下面有多个大小不等的无色细胞

图6不同形态的附着胞

注:a为附着胞有分隔，下面有无色厚壁细胞；b为附着胞有发芽缝；c为菌丝两端产生附着胞，上面附着胞为2个大小不等细胞，大细胞具发芽缝，小细胞是一个深褐色圆柱形细胞，下面的附着胞内有1个褐色球形体；d为附着胞萌发后产生分隔，上面再产生附着胞。

Fig.6Different morphological appressoria

中国已记载具有镰刀形分生孢子的炭疽菌有4种，如黑线炭疽菌与葱炭疽菌、须芒草炭疽菌(ColletotrichumandropogonisZim.)和菜豆炭疽菌(ColletotrichumphaseolorumTakimoyo)的分生孢子都是镰刀形，前3者分生孢子大小基本相似，区别在于黑线炭疽菌的分生孢子两段钝圆，而须芒草炭疽菌和菜豆炭疽菌的分生孢子两端尖锐[12]；而菜豆炭疽菌的分生孢子大小12.9～23.1μm×2.6～3.9μm，平均19.7μm×3.1μm，比黑线炭疽菌更小。该菌菌丝生长的温度为10～35℃，最适温度为25℃，孢子萌发的温度为10～35℃，菌丝生长的pH值为5～11，产孢的pH值为8～11；14h后萌发率可达到80%以上[13～14]。

2.4.2分子鉴定

对黑线炭疽菌菌丝进行DNA提取，用ITS1和ITS4的通用引物进行PCR扩增，得到长度为569 bp的特异性DNA片段。扩增 ITS区全序列，扩增结果如图7。

图7　ITS 1和ITS 4 区域的PCR扩增产物电泳图

对其扩增片段进行测序，用NCBI的Blast在Genbank中搜寻相似序列，结果与Genbank中登陆号为AB046608.1(包括ITS1 5.8S核糖体核糖核酸，ITS2 18S核糖体核糖核酸，28S核糖体核糖核酸，以及部分和全部序列)的同源性为100%。因此，确定从铁皮石斛炭疽病上分离到的菌株种类为黑线炭疽菌。

2.5寄主

黑线炭疽菌寄主范围广泛，可为害118个属植物[3]。在中国，除了为害铁皮石斛以外，还为害鸢尾(IristectorumMaim.)、 德国鸢尾(IrisgermanicaL.)[12,15]、 当归[Angelicasinensis(Oliv.) Diels][16]、 八角金盘[Fatsiajaponica(Thunb.) Decne.et Planch.]、 大豆(GlycinemaxMerr.)、 棉(GossypiumhirsutumL.)、 洋麻(HibiscuscannabinusL.)、 番茄(LycopersicumesculentumMill.)、 草木犀[Melilotusofficinalis(L.) Dest.]、 缅桂(白兰)(MicheliaalbaD.C.)、 乐昌含笑(MicxheliachapensisDanchy)、 鹤顶兰[Phaiustankervilliae(Aiton) BL.]、 蓖麻(RicinuscommunisL.)、 茄子(SolanummelogenaL.)、 梨(Pyrussp.)[12]。

2.6发病规律

2.6.1发病期

老叶在1-5月开始发病，新叶发病稍晚。在温带地区，4月开始发病，6-10月为其发病高峰期，梅雨季节发病较重。栽植过密、通风不良和环境闷热时，植株易罹此病。

2.6.2潜伏侵染

该病具有潜伏侵染特点，当植株生长衰弱时，运输期间过长或刚移栽的幼苗易发病。当铁皮石斛生长旺盛时，菌丝会侵染健康的叶片，但不发病，而病原菌以菌丝的形式潜伏在叶片组织内，当铁皮石斛在冬季遇到寒流冻害、药害、日灼、肥力不足等情况时，植株抵抗力减弱，潜伏菌丝开始活动而引起病害。

2.6.3越冬

病原菌以菌丝体在病株残体和病叶片上越冬，是翌年的初次侵染来源。

2.6.4传播途径

该病害传播有4种途径。①病株随种苗的调运进行远距离传播；②在病斑表面有分生孢子堆时，昆虫和动物在病斑上爬行，分生孢子会黏在它们的身体上进行传播；③棚内浇水时，靠水滴的溅散进行近距离传播。④盆栽铁皮石斛放置过密，叶子相互摩擦会交叉传染。

2.6.5侵入

该病原菌是兼性腐生菌，对铁皮石斛具有较强的侵染能力。病原菌可从植株伤口、气孔、皮孔处，有时也可直接穿透表皮侵入组织。日常管理时把植株碰伤或昆虫危害造成的伤口都为病原菌的侵入提供了机会。在生长季节，病菌有再次侵染现象。

2.6.6温度与湿度

病菌生长最适温为26±2℃，低于5℃或最高温达35℃则停止生长，病害减轻；分生孢子产生最适温度28～30℃，适宜pH8～11。发病适温为22～28℃，相对湿度95%以上，湿度大，病部湿润，叶片上的有水滴或水膜是病原菌产生大量分生孢子的重要条件，因此连续阴雨或浇水太多时植株发病重。

2.7防治措施

2.7.1农业技术防治

(1)清除病株

清除栽培畦内的病株、病叶，保持环境清洁，初发病时剪去受感染的铁皮石斛叶片或茎秆，及时带出栽培地烧毁或深埋，消除翌年病害的初次侵染源。

(2)喷水降温

夏季温度过高会影响铁皮石斛生长发育，生长衰弱的植株易发病，因此，夏季超过35℃时，应及时喷水降温，同时进行大棚通风，以保证铁皮石斛的正常生长。

(3)选用生长健壮、无病的种苗，可减少病害的发生。组培苗的培养时间过长，叶片会枯黄，栽培后容易发生病害，故应缩短其培养时间。

2.7.2生物防治

在发病前或初期可喷洒芽孢杆菌：①1g含1011孢子/mL活芽孢枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)可湿性粉剂喷洒，用量为750～850g/hm2。②地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)8×108个孢子/mL水剂，1 500倍喷雾。

2.7.3化学防治

发病初期喷50%多菌灵和70%甲基托布津600～800倍液，每周1次，连续喷洒2～3次。

3　结论与讨论

3.1结论

由黑线炭疽菌引起的铁皮石斛炭疽病仅为害叶片，自然发病率约为11.3%；在分离的75块组织中，真菌菌落占78.6%，隶属于5个属6种，其中黑线炭疽菌占44.1%；细菌菌落占14.7%；未长任何菌的占6.7%。经过致病性试验、形态学描述和DNA分子鉴定，确定黑线炭疽菌是引起铁皮石斛炭疽病的病原菌。

3.2讨论

铁皮石斛炭疽病，实际上就是一种叶斑病，它是根据病原菌来命名的一类病害。该病原菌寄主范围广[7]，在自然界与其他病原菌共同存在铁皮石斛栽培区域，只要条件适合，感染铁皮石斛的机会较多。

黑线炭疽菌是引起多种植物炭疽病的病原菌，但在1983年，首次报道了该菌能感染人体角膜[15～16]，患者发病前有稻谷刺伤史，这是植物病原菌也能引起人类疾病的罕见例证。鉴于这种情况，在研究该真菌引起的植物病害时，除了有效控制病原菌为害植物外，还要防止其传播感染人类。

在本次分离培养的过程中，除了大量的真菌以外，还有少量的枯草芽孢杆菌，它是一种使用范围很广的生防菌。所以，在铁皮石斛栽培过程中，尽可能地利用生防菌。

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A New Disease Caused by Colletotrichum dematium from Dendrobium officinale

ZHAO Gui-hua,ZHAO Nan

(Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry,Jurong Jiangsu 212400,P.R.China)

In order to research anthracnose ofDendrobiumofficinale,symptoms observation,isolation and culture,pathogenic fungus identification and pathogenicity test were carried out in both laboratory and cultivation field respectively.The results showed thatColletotrichumdematiumonly damage leaf,the average incidence was 11.3%.C.dematiumaccounted for 44.1% among of the isolated 59 fungal colony.The research confirms that pathogenic fungus caused byD.officinaleanthracnose wasC.dematiumafter morphological description,DNA sequencing to identify and pathogenicity test.C.dematiumis the first reported pathogenic fungus onD.officinalein China.

Dendrobiumofficinale;pathogenic fungus;identification；Colletotrichumdematium

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.03.004

2015-09-01

国家自然科学基金(No.31170605)，江苏省科技支撑计划(BE2014385)，江苏农林职业技术学院科技创新团队项目(2015kj036)。

赵桂华(1952-)，男，教授，长期从事植物病害研究。E-mail:1723686916@qq.com

S 763

A

1672-8246(2016)03-0020-06