S100A6 siRNA的构建及鉴定

冯珊珊，杨　博，刘爱琴，武　婧，翟惠虹

(宁夏医科大学总医院：1. 外科学研究室；2. 消化内科，宁夏银川　750004)



◇技术方法研究◇

S100A6siRNA的构建及鉴定

冯珊珊1，杨博2，刘爱琴2，武婧2，翟惠虹2

(宁夏医科大学总医院：1. 外科学研究室；2. 消化内科，宁夏银川750004)

目的利用小片段干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)抑制S100A6蛋白的表达，为研究CacyBP/SIP核转位机制提供有利的工具。方法设计S100A6的siRNA序列，用脂质体LipofectamineTM2000将siRNA转染至人结肠癌SW480细胞中，在荧光显微镜下观察转染效率，用Real-timePCR及Westernblot方法检测S100A6在人结肠癌SW480细胞内的mRNA和蛋白表达。结果构建了3对S100A6-siRNA，荧光显微镜下检测转染人结肠癌SW480细胞成功；RT-PCR证明了在SW480细胞内S100A6的mRNA表达显著降低(P<0.05)；Westernblot证明了SW480细胞内S100A6蛋白表达显著降低(P<0.05)；与S100A6si-1、S100A6si-3组相比，S100A6si-2组对S100A6的mRNA和蛋白抑制效果最明显(P<0.05)。结论成功构建了S100A6-siRNA，为CacyBP/SIP核转位机制研究提供了有利的工具。

结肠癌；S100A6；siRNA；钙周期素结合蛋白

钙周期素结合蛋白[calcyclin(S100A6)-binding-protein,CacyBP]是1998年从小鼠艾氏腹水瘤细胞中发现的以钙依赖方式结合S100A6的蛋白[1]；2001年发现一种人Siah-1结合蛋白(Siah-1interactingprotein,SIP)与CacyBP序列相同，从此命名为CacyBP/SIP[2]。本课题组前期研究发现，钙周期素结合蛋白(CacyBP/SIP)在结肠癌组织及结肠癌SW480细胞中高表达[3-4]。研究还发现，在结肠癌细胞中，CacyBP/SIP在细胞质表达，给予胃泌素[4-5]、表皮生长因子[6]、前列腺素E2[7]、缺氧[8]刺激后，CacyBP/SIP转位于细胞核。进一步研究发现，CacyBP/SIP核转位促进了结肠癌细胞的增殖[4]，且CacyBP/SIP核转位后可能与核内的细胞周期调控因子结合[9]。细胞核是细胞的代谢、生长、分化及遗传物质的调控中心。因此，CacyBP/SIP核转位可能与结肠癌的发生发展有关，但CacyBP/SIP的核转位机制尚不明确。根据CacyBP/SIP结构分析，CacyBP/SIP通过Ca2+可以结合S100蛋白家族中的S100A1、S100A6、S100B、S100P[10]。我们前期实验发现，S100A6可能导致CacyBP/SIP发生依赖Ca2+浓度方式的核转位。因此，本研究通过S100A6-siRNA的构建及鉴定，为CacyBP/SIP的核转位机制研究提供有利的工具。

1　材料与方法

1.1材料人结肠癌SW480细胞(北京协和细胞库)；S100A6-siRNA(上海吉玛公司)；无内毒素质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司)；小鼠抗人S100A6单克隆抗体、HRP标记羊抗鼠二抗(Santa公司)；SYBRGreenPCRMasterMix(ABI公司)；逆转录cDNA试剂盒(Fermentas公司)；LipofectamineTM2000、Trizol(美国Invitrogen公司)；DNA引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养结肠癌SW480细胞用含有100mL/L胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的IMEM培养液，37 ℃、50mL/LCO2条件下培养，48h更换1次培养液，用2.5g/L胰酶消化传代，细胞传代3～4次后进行转染。

1.2.2S100A6-siRNA引物设计根据GenBank提供的S100A6基因cDNA序列(编号GI：NM_014624)，选择S100A6的靶点序列设计引物(表1)。

表1S100A6-siRNA序列

Tab.1SequenceofS100A6-siRNA

GenesiRNAsequenceTargetsites阴性对照组Sense:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'Anti-sense:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'S100A6si-1Sense:5'-GCGAAUGUGCGUUGUGUAATT-3'Anti-sense:5'-UUACACAACGCACAUUCGCTT-3'120～138S100A6si-2Sense:5'-GUGGCCAUCUUCCACAAGUTT-3'Anti-sense:5'-ACUUGUGGAAGAUGGCCACTT-3'349～367S100A6si-3Sense:5'-CCUCUCUGAGUCAAAUCCATT-3'Anti-sense:5'-UGGAUUUGACUCAGAGAGGTT-3'624～642

1.2.3基因转染取对数生长期的SW480细胞，以(5～6)×104/孔细胞接种于6孔板，细胞达到80%～90%融合时进行细胞转染，转染前更换无抗生素培养基过夜。按照LipofectamineTM2000步骤转染siRNA，将7.5μL标记荧光素的阴性对照siRNA转染至SW480细胞，转染6h后更换无抗生素的完全培养液，24～72h内荧光显微镜下检测转染效率。

1.2.4Real-timePCR检测S100A6-siRNA效率本实验分为空白组、阴性对照组、S100A6si-1组、S100A6si-2组、S100A6si-3组，检测转染72h后各组细胞S100A6的mRNA表达水平。以β-actin为内参，采用Primer4.0软件设计引物[10](表2)。分别提取各组细胞总RNA，以总RNA为模板反转录为cDNA，用SYBRGreenⅠ荧光染料进行PCR扩增。PCR扩增反应条件为：95 ℃预变性，5min；94 ℃变性，20s；退火59 ℃，20s；延伸72 ℃，20s；40个循环。采用Real-timePCR中相对定量比较Ct值法计算各组S100A6mRNA的相对表达水平，并根据各组表达倍数差异得出抑制率。

表2RT-PCR引物序列和长度

Tab.2SequenceandlengthofS100A6-siRNA

GeneSequenceLengthS100A6Forward:5'-GGGAGGGTGACAAGCACAC-3'Reverse:5'-AGCTTCGAGCCAATGGTGAG-3'79bpβ-actinForward:5'-CATTAAGGAGAAGCTGTGCT-3'Reverse:5'-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3'208bp

1.2.5Westernblot方法检测各组细胞中S100A6蛋白的表达实验分组及转染步骤同上。转染72h后分别提取各组总蛋白，用BCA蛋白分析试剂测定蛋白浓度。取30μg总蛋白进行100g/LSDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜进行免疫印迹，以GAPDH为内参，检测S100A6的蛋白表达水平。

2　结　　果

2.1siRNA阴性对照转染结肠癌SW480细胞用siRNA阴性对照片段标记荧光素FAM摸索转染条件，3组S100A6-siRNA按阴性对照条件进行转染。经检测，转染后72h，转染效率>80%(荧光镜下细胞数/光镜下细胞数)，转染效果较理想，可进行后续实验(图1)。

2.2结肠癌SW480细胞总RNA的表达各组转染SW480细胞，提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测发现28S和18S特征性条带，证明细胞总RNA完整性较好，无明显降解发生(图2)。

2.3结肠癌SW480细胞S100A6mRNA的表达采用Real-timePCR法观察S100A6在结肠癌SW480细胞内的mRNA表达，β-actin为内参,得到扩增曲线和熔解曲线(图3)，熔解曲线为单峰，扩增产物特异性好，无引物二聚体形成，实验结果可靠。

图1对照siRNA转染人结肠癌SW480细胞Fig.1ControlplasmidwastransfectedinSW480cells(×400)

A：光镜下细胞数；B：荧光镜下细胞数。

图2SW480细胞总RNA的电泳结果

Fig.2TotalmRNAlevelofSW480cells1. 空白组；2. 对照组；3.S100A6si-1；4.S100A6si-2；5.S100A6si-3。

图3扩增曲线和熔解曲线

Fig.3Amplificationcurveandmeltcurve

A：扩增曲线；B：熔解曲线。

2.4S100A6mRNA的相对定量结果采用Real-timePCR中相对定量比较Ct值法比较目的基因mRNA的相对含量。结果显示，siRNA-S100A6实验组与阴性对照组相比，mRNA的表达明显降低(P<0.05)；S100A6si的3个实验组相比，S100A6si-2组抑制效果最好(P<0.05)，抑制率达到87.9%；空白组与阴性对照组之间差异无统计学意义(P>0.05，表3、图4)。提示从mRNA水平上证明了S100A6-siRNA明显抑制了SW480细胞内S100A6的表达。

表3各组间S100A6mRNA的表达倍数

Tab.3mRNAexpressionlevelofS100A6-siRNAindifferentgroups

组别ΔCt值△△Ct倍数(2-△△Ct)空白组6.896±0.0440.000±0.0441.000阴性对照组6.891±0.0150.036±0.0150.976S100A6si-1组8.935±0.1102.080±0.1100.237S100A6si-2组9.910±0.1173.055±0.1170.121S100A6si-3组7.632±0.0770.777±0.0770.584

图4S100A6在结肠癌SW480细胞中的mRNA表达

Fig.4mRNAexpressionlevelofS100A6incolonSW480cells

与对照组比较，*P<0.05；与S100A6si-2比较，#P<0.05。

2.5结肠癌SW480细胞中S100A6蛋白的表达免疫印迹结果证明，S100A6siRNA实验组的蛋白表达明显降低(P<0.05，图5)，S100A6siRNA实验组与对照组相比有统计学差异(P<0.05)，S100A6si-2组与S100A6si-1、S100A6si-3组比较有统计学差异(P<0.05)。提示S100A6si-2组抑制效果最好(P<0.05)，抑制率达到85.0%；空白组与阴性对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)，提示从蛋白水平证明了S100A6在结肠癌SW480细胞内的表达受抑制。

3　讨　　论

在胃癌细胞中发现，胃癌的多药耐药性与CacyBP/SIP上调有关，并且CacyBP/SIP可以调控胃癌细胞对化疗药物的应答反应[11]，首次发现CacyBP/SIP可能是胃癌多药耐药治疗的潜在靶点。本课题组早期制备了CacyBP/SIP的单克隆抗体[12]。随后研究了CacyBP/SIP在正常组织及肿瘤组织中的表达，发现CacyBP/SIP在正常结肠黏膜组织不表达，在结肠癌组织中高表达[3]。进一步研究了CacyBP/SIP在不同大肠组织中的表达，发现CacyBP/SIP在大肠增生性息肉中不表达，在大肠腺瘤组织、大肠癌组织中高表达。提示CacyBP/SIP可能参与了大肠癌的发生发展[13]。研究还发现，CacyBP/SIP在结肠癌SW480细胞中亦高表达[5]。

图5S100A6在结肠癌SW480细胞中的蛋白表达

Fig.5ProteinexpressionlevelofS100A6incolonSW480cells

A：S100A6转染结肠癌SW480细胞的相对蛋白表达量(1：空白组；2：对照组；3：S100A6si-1；4：S100A6si-2；5：S100A6si-3)。B：不同转染组S100A6/GAPDH的相对表达比较，与对照组比较，*P<0.05；与S100A6si-2比较，#P<0.05。

FILIPEK[14]、WU[15]在小鼠神经母细胞瘤NB-2a细胞和人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中发现，CacyBP/SIP具有Ca2+依赖的核转位现象。本课题组在结肠癌SW480细胞中发现，CacyBP/SIP在细胞质表达，给予胃泌素[4-5]、细胞外刺激因子如表皮生长因子[6]、前列腺素E2[7]、缺氧[8]刺激，可以诱导CacyBP/SIP转位至细胞核。研究还发现，在胃癌细胞[16]和结肠癌细胞[5]中，CacyBP/SIP转位至细胞核后可以促进细胞增殖，使G1期缩短。提示CacyBP/SIP通过核转位参与了细胞周期调控。我们进一步筛选并验证了结肠癌核转位后的下游信号分子[9]。但是CacyBP/SIP的核转位机制尚不明确。

根据CacyBP/SIP的结构分析，CacyBP/SIP可以和S100蛋白家族、Skp1、tubulin及ERK1/2四个靶蛋白结合[17]，而S100蛋白是唯一依赖Ca2+结合CacyBP/SIP的靶蛋白。因此，S100蛋白可能调控CacyBP/SIP依赖Ca2+浓度的核转位现象。FILIPEK[1]最早在小鼠艾氏腹水瘤细胞中以S100A6的配体形式发现CacyBP/SIP。本课题组前期研究发现，在结肠癌SW480细胞中，给予Ca2+刺激，S100A6可以与CacyBP/SIP结合。S100A6是分子量为10.5ku的小分子钙离子结合蛋白，它可以以被动转运方式通过核膜进入细胞核[18]。S100A6在上皮细胞、纤维细胞及不同的肿瘤细胞中高表达，功能研究中发现S100A6参与细胞增殖、细胞骨架动力学和肿瘤形成[19]。综上提示，S100A6可能是在结肠癌细胞中引起CacyBP/SIP核转位的靶蛋白。

在本课题中，抑制S100A6与CacyBP/SIP结合的方法有两种：①在CacyBP/SIP的S100A6结合区构建缺失突变体(CacyBP△S1000A6)；②利用siRNA沉默S100A6的表达。为排除因CacyBP/SIP结构改变而影响其核转位的情况，本研究选择沉默S100A6构建siRNA。RNAi可以被诱导(小于22个碱基片段的RNA，称为小干扰RNA，siRNA)载入到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，使RNA双链特异性被降解，导致相应的基因沉默，是目前用于沉默同源基因转录后表达的分子技术。这种由21个碱基合成的siRNA可以在细胞内触发基因沉默，并发现比长片段(如shRNA)的沉默效率更高，尤其是将siRNA导入触发基因沉默的细胞中效果更明显，原因是在Dicer酶表达量低的细胞中，shRNA的基因沉默功能会受到削弱，但是siRNA不会受到影响。本实验针对人S100A6的mRNA，选择了3条特异性siRNA靶序列，分别构建了3组siRNA转染至人结肠癌SW480细胞，转染S100A6si-2组抑制mRNA和蛋白的表达效果最好，表明S100A6siRNA构建成功。

本研究将S100A6-siRNA转染至结肠癌SW480细胞，从mRNA和蛋白水平鉴定了S100A6-siRNA沉默了S100A6的表达，为CacyBP/SIP核转位机制研究提供了有利的工具。

[1]FILIPEKA,KUZNICKIJ.MolecularcloningandexpressionofamousebraincDNAencodinganovelproteintargetofcalcyclin[J].JNeurochem, 1998, 70:1793-1798.

[2]MATSUZAWAS,REEDJC.Siah-1,SIP,andEbicollaborateinanovelpathwayforbeta-catenindegradationlinkedtop53responses[J].MolCell, 2001, 7:915-926.

[3]ZHAIHH,SHIY,JINH,etal.Expressionofcalcyclin-bindingprotein/Siah-1interactingproteininnormalandmalignanthumantissues:animmunohistochemicalsurvey[J].JHistochemCytochem, 2008, 56:765-772.

[4] 翟惠虹.CacyBP/SIP核转位在结肠癌中的意义[D]. 第四军医大学, 2007:1-129.

[5] 翟惠虹，陈雄，卢媛媛，等. 结肠癌细胞中CacyBP/SIP的表达及核转位现象[J]. 世界华人消化杂志, 2008, 16(35):3953-3957.

[6] 谢福利，仇长青，翟惠虹，等. 二氯化钴致人结肠癌细胞系CacyBP/SIP核转位[J]. 基础与临床, 2012, 32(11):1312-1317.

[7] 谢福利，翟惠虹. 缺氧对结肠癌细胞CacyBP/SIP核转位的影响[J]. 重庆医学, 2012, 41(29):3020-3022.

[8] 谢福利，翟惠虹. 表皮生长因子对CacyBP/SIP过表达慢病毒载体转染的结肠癌细胞CacyBP/SIP核转位的影响[J]. 山东医药, 2012, 52(23):1-4.

[9] 王安萍，赵盈盈，翟惠虹，等. 人结肠癌细胞中CacyBP/SIP核转位差异表达基因的验证[J]. 天津医药, 2014, 42(5):410-413.

[10]FILIPEKA,MICHOWSKIW,KUZNICKIJ.InvolvementofS100A6 (calcyclin)anditsbindingpartnersinintracellularsignalingpathways[J].AdvEnzymeRegul, 2008, 48:225-239

[11]SHIYQ,HUWH,YINF, et al.Regulationofdrugsensitivityofgastriccancercellsbyhumancalcyclin-bindingprotein(CacyBP)[J].GastricCancer, 2004, 7:160-166.

[12]ZHAIHH,SHIY,YUJ,etal.Establishmentandcharacterizationofcalcyclinbindingprotein(CacyBP)monoclonalantibody[J].Hybridoma(Larchmt), 2006, 25(2):91-4.

[13] 翟惠虹，冯珊珊，仇长青，等.CacyBP/SIP在不同大肠组织中的表达及临床意义[J]. 世界华人消化杂志, 2014, 22(9):1328-1333.

[14]FILIPEKA,JASTRZEBSKAB,NOWOTNYM,etal.Ca2+-dependenttranslocationofthecalcyclin-bindingproteininneuronsandneuroblastomaNB-2acells[J].JBiolChem, 2002, 277:21103-21109.

[15]WUJ,TANX,PENGX, et al.Translocationandphosphorylationofcalcyclinbindingproteinduringretinoicacid-inducedneuronaldifferentiationofneuroblastomaSH-SY5Ycells[J].JBiochemMolBiol, 2003, 36:354-358.

[16]ZHAIHH,MENGJ,WANGJB, et al.CacyBP/SIPnucleartranslocationinducedbygastrinpromotesgastriccancercellproliferation[J].WorldJGastroenterol, 2014, 20:10062-10070.

[17]SCHNEIDERG,FILIPEKA.S100A6bindingproteinandSiah-1interactingprotein(CacyBP/SIP):spotlightonpropertiesandcellularfunction[J].AminoAcids, 2011, 41:773-780.

[18]BOOTMANMD,FEARNLEYC,SMYRNIASI,etal.Anupdateonnuclearcalciumsignalling[J].JCellSci, 2009, 122(Pt14):2337-2350.

[19]DONATOR,CANNONBR,SORCIG,etal.FunctionsofS100proteins[J].CurrMolMed, 2013, 13:24-57.

(编辑卓选鹏)

ConstructionandidentificationofS100A6-siRNA

FENGShan-shan1,YANGBo2,LIUAi-qin2,WUJing2,ZHAIHui-hong2

(1.SurgeryLaboratory; 2.DepartmentofDigestiveDiseases,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

ObjectiveToinhibittheexpressionofS100A6proteinwithshortinterferingRNA(siRNA)soastoprovideausefultoolforstudyingcalcyclin(S100A6)-binding-protein(CacyBP)/SIPnucleartranslocationmechanism.MethodsThesiRNAsoftheS100A6codingsequenceweredesignedandtransientlytransfectedtohumancoloncancerSW480cellsbyLipo-fectamine2000.Westernblotandsemi-quantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)analyseswereusedtoexaminetheexpressionofS100A6inthesetransfectants.ResultsS100A6-siRNAwasconstructedandtransientlytransfectedsuccessfullytohumancoloncancerSW480cellsunderthefluorescencemicroscope.SilentexpressionofS100A6atthemRNAandproteinlevelswasconfirmedbyRT-PCRandWesternblot,respectively(bothP<0.05).TheinhibitoryeffectwasthemostobviousinS100A6si-2group(P<0.05).ConclusionTheavailabletooloftheCacyBP/SIPnucleartranslocationmechanismhasbeenprovidedbyconstructingtheS100A6-siRNA.

coloncancer;S100A6;siRNA;CacyBP/SIP

2016-02-15

2016-05-12

国家自然科学基金资助项目(No.81072040)；宁夏自然科学基金资助项目(No.NZ0897))；宁夏医科大学重点资助项目(No.XZ201413)

翟惠虹.E-mail:zhaihuihong@263.net

R57

A

10.7652/jdyxb201605028

SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.81072040),theNaturalScienceFoundationofNingxia(No.NZ0897),andtheKeyResearchFundsofNingxiaMedicalUniversity(No.XZ201413)

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160805.1016.012.html(2016-08-05)