上调miR-181a对胃癌细胞AGS增殖和凋亡的影响

余钧辉，孙学军，郑见宝，王孝珑，魏光兵，高　琪，王　恺

(西安交通大学第一附属医院普通外科，陕西西安　710061)



◇基础研究◇

上调miR-181a对胃癌细胞AGS增殖和凋亡的影响

余钧辉，孙学军，郑见宝，王孝珑，魏光兵，高琪，王恺

(西安交通大学第一附属医院普通外科，陕西西安710061)

目的探讨miR-181a对胃癌细胞增殖、周期及凋亡的影响及其作用机制。方法荧光实时定量PCR检测5种胃癌细胞及人胃黏膜细胞系GES-1中miR-181a的表达情况，以及胃癌细胞AGS瞬时转染miR-181amimic后miR-181a的表达情况；MTT法和流式细胞仪检测上调miR-181a表达对胃癌细胞AGS增殖、周期和凋亡等生物学行为的影响；Westernblot检测上调miR-181a后细胞周期调控蛋白(CDC25A、cyclinA2、cyclinD1、p21)和凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax)的表达变化。结果与人胃黏膜细胞系GES-1比较，miR-181a在人胃癌细胞株SGC-7901和MKN28表达升高(P均<0.01)，在MGC-803、BGC-823、AGS表达差异无统计学意义(P均>0.05)；瞬时转染miR-181amimic后，胃癌细胞AGS中miR-181a的表达明显上调(P<0.05)；转染miR-181amimics后AGS细胞增殖明显，G0/G1期细胞减少，S期细胞明显增多，细胞凋亡明显减弱(P均<0.05)。Westernblot结果显示，上调miR-181a后胃癌细胞AGS中CDC25A、cyclinA2和Bcl-2表达升高(P均<0.05)，cyclinD1和p21表达差异没有统计学意义(P>0.05)，Bax表达降低(P<0.05)。结论上调miR-181a可以促进胃癌细胞AGS增殖，其作用机制可能与CDC25A、CyclinA2表达升高有关；上调miR-181a可抑制胃癌细胞凋亡，其作用机制可能与Bcl-2表达升高及Bax表达降低有关。

miR-181a；胃癌；增殖；凋亡；细胞周期

胃癌是最为常见的消化道肿瘤之一，全球的胃癌发病率达到第四位，并且在肿瘤相关的死亡中位列第二[1]。microRNA(miRNA,miR)是一类19～25个核苷酸大小的内源非编码小分子RNA，是真核生物中广泛存在的一类重要的调控分子，通过与靶基因信使RNA(mRNA)的3′非编码区(3′-UTR)特异性的碱基配对引起mRNA的降解或翻译抑制，从而发挥对靶基因的转录后沉默作用[2]。生物学分析认为，miRNA调控着人类大约30%的基因，参与调控包括分化、增殖以及凋亡等多个细胞生物学过程[3]。因此，miRNA的表达失调与肿瘤等疾病密切相关。目前的研究显示，所有的实体肿瘤中都存在miRNA表达谱的显著差异，而这些差异表达的miRNA有望成为癌症治疗的新靶点[4]。miR-181a是miR-181家族成员之一，在多种肿瘤的发生发展中起着重要作用。本课题组前期的工作已经证实miR-181a在胃癌组织中高表达，为了进一步探讨其在胃癌发生发展中的作用，本研究采用miR-181amimics上调人胃癌细胞AGS中miR-181a的表达，检测其对胃癌细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响，探讨可能的作用机制。

1　材料与方法

1.1主要试剂和仪器Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit(ThermoScientific公司)；Real-timePCR(日本TaKaRa公司)；Real-timePCR检测仪(美国Bio-Rad公司，CFX96TMReal-timePCRDetectionSystem)；miR-181a、U6引物由广州锐博生物科技有限公司设计并合成；RPMI-1640培养基(美国Corning公司)；胎牛血清(法国Biowest公司)；LipofectamineTM2000 转染试剂(美国Invitrogen公司)；OPTI-MEN(美国Gibco公司)；AnnexinV-FITC试剂盒(美国BD公司)；MTT(美国Sigma公司)；miR-181amimics及NegativeControl(NC)(上海吉玛公司)；CDC25A、cyclinA2、cyclinD1和GAPDH抗体(美国SantaCruz公司)，Bcl-2和Bax(美国Abcam公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2细胞培养GES-1、SGC-7901、MGC-803、AGS、BGC-823和MKN28为本实验室长期保存，采用RPMI1640培养基(含100mL/L胎牛血清)，于37 ℃、50mL/LCO2培养箱中培养，每天观察并更换细胞培养液1次，待细胞长满约80%时，用2.5g/L胰蛋白酶消化传代，取生长状态良好的对数生长期细胞用于实验。

1.3总RNA提取及Real-timePCR用Trizol试剂按照操作说明书，分别提取人胃黏膜细胞系GES-1和5株胃癌细胞的总RNA，各取2μgRNA进行反转录成cDNA，行Real-timePCR。反应条件：95 ℃预变性30s；然后按95 ℃ 5s，60 ℃ 30s进行40个循环。以每个样本的U6作为内参，基因相对表达量采用2-△△Ct方法进行计算分析。实验重复3次。

1.4细胞转染将对数生长期SGC-7901细胞按2×104个接种于6孔板，按照实验设计分组，实验组(转染miR-181amimics)、阴性对照组(转染negativecontrol)和空白对照组(untreatedcell，只加转染试剂)。用250μLOPTI-MEN稀释LipofectamineTM2000转染试剂5μL，室温下静置5min，再用250μLOPTI-MEN稀释miR-181amimics或negativecontrol5μL，两者混合室温下静置20min，每孔加入500μL中的转染复合液，在50mL/LCO2、37 ℃培养箱中孵育4～6h，用新鲜的完全培养基(含血清)替换含有转染复合物的培养基，供后续实验使用。实验重复3次。

1.5MTT法检测细胞增殖将胃癌细胞按照5×103个/孔接种于96孔板中，按1.4项随机分为实验组、阴性对照组和空白对照组，每组设4个复孔；未接种细胞的孔中加入RPMI1640培养基作为调零孔。接种后24、48、72、96h各检测1次，每孔加入MTT20μL继续在培养箱中孵育4h，用酶标仪检测其490nm处吸光度(A)值。实验重复3次。

1.6流式细胞仪检测细胞周期按2×105个/孔接种胃癌细胞于6孔板中，按1.4项分组为实验组、阴性对照组和空白对照组，转染48h换为无血清培养基，24h后再换成含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基培养24h，用胰酶消化收集各组细胞，并用预冷PBS洗涤3次，1 000r/min，5min/次，弃上清。加入―20 ℃ 预冷的750mL/L冰乙醇1mL固定细胞，置于4 ℃冰箱过夜。检测前离心(1 000r/min，5min)，PBS洗涤2次；加入100μLPBS并将细胞吹悬；用含0.1g/LRNase和5g/L碘化丙锭(PI)4 ℃处理细胞20min。过300目尼龙网。送流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.7AnnexinV-FITC染色检测凋亡胃癌细胞按2×105个/孔接种于6孔板并按1.4项分组，转染后24h按照AnnexinV-FITC试剂盒说明进行染色，并在1h内进行流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.8Westernblot检测CDC25A、cyclinA2、cyclinD1、p21、Bcl-2及Bax的表达胃癌细胞按2×105个/孔接种于6孔板并按1.4项分组，转染72h后收集各组细胞，提取细胞总蛋白并用BCA法检测总蛋白浓度，每组样本取10μL进行100g/LSDS-PAGE垂直电泳，湿转法将胶中蛋白水平转移至PVDF膜上，50g/L脱脂牛奶在37 ℃摇床上封闭1h，先后分别加入TBST稀释后的一抗(4 ℃过夜)、二抗，经ECL显影，凝胶成像系统扫描，采用相关图像分析软件(Bio-radQuantityOne,CA)进行条带灰度分析。GAPDH作为参照蛋白。

2　结　　果

2.1人胃黏膜细胞系和胃癌细胞的miR-181a表达变化与人胃黏膜细胞系GES-1组比较，人胃癌细胞MKN28和SGC-7901中miR-181a相对高表达，差异有统计学意义(P均<0.01)，而MGC-803、BGC-823、AGS等胃癌细胞中miR-181a的表达与GES-1细胞相比，差异无统计学意义(P均>0.05，图1)。后续功能学研究选用miR-181a表达较低的胃癌细胞AGS为实验细胞，采用miR-181amimics上调其miR-181a表达。

图1人胃黏膜细胞系GES-1及5种人胃癌细胞中miR-181a的表达

Fig.1ExpressionofmiR-181ainfivegastriccancercelllinesandnormalgastriccancercelllineGES-1

2.2转染24h后miR-181a的表达变化胃癌细胞AGS转染miR-181amimics后，miR-181a的表达较阴性对照组显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组和空白对照组差异无统计学意义(P>0.05，图2)。

图2胃癌细胞株AGS转染miR-181amimics24h后miR-181a的表达

Fig.2ExpressionofmiR-181aingastriccancercellAGSaftertransfectionwithmiR-181amimics

2.3miR-181a对胃癌细胞增殖的影响MTT检测结果显示，胃癌细胞AGS转染miR-181amimics后24、48、72h的生长速度相对阴性对照组，差异没有统计学意义(P均>0.05)，96h生长速度明显增快，差异有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组和空白对照组间差异没有统计学意义(P>0.05，图3)。

图3胃癌细胞AGS转染miR-181amimics后的细胞生长曲线

Fig.3CellgrowthcurvesofgastriccancercellAGSaftertransfectionwithmiR-181amimics

2.4miR-181a对胃癌细胞周期的影响流式细胞仪检测结果显示，人胃癌细胞AGS转染miR-181amimics组的G0/G1期细胞比例较阴性对照组明显减少(P<0.05)，S期细胞比例增多(P<0.05)，G2/M期细胞比例差异没有统计学意义 (P>0.05)。阴性对照组和空白对照组间差异没有统计学意义(P>0.05，图4、表1)。

图4流式细胞术检测胃癌细胞AGS转染miR-181amimics时的细胞周期变化

Fig.4CellcycledistributionofgastriccancercellAGSaftertransfectionwithmiR-181amimicsdetectedbyflowcytometry

A：miR-181amimics(转染组)；B：Negativecontrol(阴性对照组)；C：Untreatedcell(空白对照组)。

表1胃癌细胞AGS转染miR-181amimics时细胞周期时相的分布

Tab.1　Cell cycle distribution of gastric cancer cell AGS after transfection with miR-181a mimics(%, ±s)

与阴性对照组比较，*P<0.05；与空白对照组比较，#P<0.05。2.5miR-181a对胃癌细胞凋亡的影响转染miR-181amimics的人胃癌细胞AGS的凋亡比例较阴性对照组减少，差异有统计学意义(P<0.05)。阴性对照组和空白对照组间差异没有统计学意义(P>0.05，图5)。

图5流式细胞仪检测各组AGS细胞凋亡的结果(A、B、C)及凋亡率的比较(D)

Fig.5ApoptosisineachgroupofAGScellsdetectedbyflowcytometryandcomparisonofapoptosisratesamonggroups

A、B、C：分别为转染组、阴性对照组、空白对照组；D：1～3分别为转染组、阴性对照组、空白对照组。

2.6miR-181a对胃癌细胞周期蛋白表达的影响AGS细胞miR-181amimics转染组的CDC25A、cyclinA2 表达较阴性对照组明显升高(P<0.05)，cyclinD1 及p21表达差异没有统计学意义(P>0.05)。阴性对照组和空白对照组间差异没有统计学意义(P>0.05，图6)。

2.7miR-181a对胃癌细胞Bcl-2及Bax表达的影响AGS细胞转染miR-181amimics组的抗凋亡蛋白Bcl-2表达较阴性对照组明显升高，凋亡蛋白Bax表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。阴性对照组和空白对照组间差异没有统计学意义(P>0.05，图7)。

3　讨　　论

胃癌的发生发展涉及到多种癌基因、抑癌基因、凋亡调节基因等的异常表达，是一个复杂的病变过程[5]。miRNA作为新的研究切入点，为癌症的诊断与治疗开辟了一条新途径。研究表明，胃癌组织中存在着差异表达的miRNA，可能与细胞增殖、凋亡的调控及癌细胞对化疗药物的敏感性相关，理解这些miRNA有助于为胃癌的诊断和监测提供新的潜在分子靶标[6-7]。

miR-181a是近年来受到众多关注的miRNA之一，家族成员包括已知的miR-181a、miR-181b、miR-181c及miR-181d等4个成熟序列。其中，miR-181a是miR-181家族的重要成员，与肿瘤的发生发展关系密切。miR-181a在乳腺癌[8]、肝癌[9]和头颈部肿瘤[10]表达上调，发挥着癌基因的作用，而在胶质瘤[11]、结肠癌[12]中miR-181a表达下调，发挥抑癌基因的作用。此外，miR-181a参与肿瘤细胞增殖[13]、凋亡[14]及耐药性[15]等生物学行为过程。然而，miR-181a在胃癌中的研究较少且存在争议。本课题组前期工作采用Real-timePCR检测了miR-181a在42例胃癌组织及配对的正常组织的表达情况，证实miR-181a在胃癌组织中高表达，但是对胃癌的细胞生物学行为的影响以及具体的作用机制，目前仍未见阐明。

图6AGS各组细胞CDC25A、cyclinA2、p21及cyclinD1的表达变化

Fig.6ProteinexpressionsofCDC25A,cyclinA2,p21andcyclinD1ineachgroupofAGScells

A：Westernblot条带；1：转染组；2：阴性对照组；3：空白对照组；B：各组细胞周期蛋白表达量的比较。

图7AGS各组细胞Bcl-2和Bax表达的变化

Fig.7ProteinexpressionsofBcl-2andBaxineachgroupofAGScells

A：Westernblot条带；1：转染组；2：阴性对照组；3：空白对照组。B：蛋白表达结果的统计学分析。

本研究上调miR-181a表达并观察其对胃癌细胞增殖、凋亡的影响并探讨可能的作用机制。MTT结果显示，上调miR-181a具有促进胃癌细胞AGS增殖的作用；细胞周期结果表明，上调miR-181a时，G0/G1期细胞比例明显减少，S期细胞比例增多。这提示miR-181a促进胃癌细胞AGS增殖及G1/S期转化。ZHANG等[16]采用MTT和软琼脂克隆形成实验结果也显示上调miR-181a可促进胃癌细胞增殖。

本研究进一步采用Westernblot检测了4个细胞周期调节因子。CDC25A是细胞分裂周期基因CDC25 (celldivisioncycle25)家族中最为重要的成员，CDC25A对于G1/S、G2/M期转换至关重要。CDC25A通过对细胞周期蛋白依赖性激酶2-细胞周期素E复合物(CDK2-cyclinE)和CDK2-cyclinA的去磷酸化作用而促进细胞进入S期。因此，CDC25A高表达可加速G1/S期的转化，下调其表达则会导致S期的阻滞[17]。本研究结果表明，转染了miR-181amimics的AGS细胞的CDC25A、cyclinA2表达明显升高。提示miR-181a可能通过CDC25A、cyclinA2通路促进胃癌细胞G1/S期转化。抑癌基因p21是一个广谱的细胞周期依赖性激酶抑制剂和细胞周期的负调控因子，具有阻止细胞通过G1/S期的作用；癌基因cyclinD1参与G1/S期转换的调控，是细胞周期重要的正性调控因子。ZHU等[18]研究发现miR-181a可通过p21的表达促进骨肉瘤细胞MG63增殖。本研究上调miR-181a时，p21和cyclinD1的表达差异没有统计学意义。提示miR-181a可能通过不同的信号途径参与不同肿瘤细胞增殖的调控。

miR-181a是调节多种肿瘤细胞凋亡的重要因子。JIAO等[19]研究发现，乳腺癌耐药株MCF-7/MX的miR-181a表达较亲本MCF-7细胞株下调，而上调miR-181a表达可增加MCF-7/MX对抗肿瘤药物米托蒽醌(mitoxantrone)的敏感性；还证实miR-181a通过调节乳腺癌耐药蛋白(BRCP)表达而影响肿瘤药物的耐药性。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的两个关键成员，Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体调节细胞凋亡：当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；Bax与Bcl-2形成异源二聚体时则抑制细胞凋亡。本研究结果显示，上调胃癌细胞miR-181a时，凋亡比例降低，Westernblot结果可见Bcl-2表达升高，Bax降低。这提示miR-181a可能抑制Bax同源二聚体形成和促进Bax/Bcl-2异源二聚体形成而抑制细胞凋亡，这与ZHU[17]在骨肉瘤中的miR-181a研究结论一致，但具体机制有待于进一步研究。

研究表明血清中特异性表达的miRNA有望成为胃癌诊断及预后的监测指标。WANG等[20]发现，血清中miR-17-5p/20a的表达水平与胃癌的分化程度及TNM分期密切相关，生存曲线分析发现高表达的miR-17-5p/20a往往预示着不良的预后，提示miR-17-5p/20a有望成为判断胃癌进展程度及预后的良好的标志物。GUO等[21]发现，血清中miR-181a诊断乳腺癌的灵敏度及特异度达到70.7%和59.9%，远高于传统的乳腺癌诊断标志物CA153和CEA，预示着miR-181a具有成为乳腺癌诊断标志物的潜力。血清miRNA检测具有无创性、稳定性好、灵敏度高等优点，具备成为理想肿瘤标记物的条件。本课题组前期的研究表明miR-181a在胃癌组织中高表达，提示miR-181a有可能成为胃癌的诊断的新一代标志物。目前仍未有血清中miR-181a与胃癌研究的报道，这也是本课题今后研究的一个方向。

综上所述，上调miR-181a能够促进胃癌细胞的增殖活性，抑制胃癌凋亡，提示miR-181a在胃癌中可能扮演致癌基因的角色，这与其在胃癌组织中表达上调时的生物作用一致。在后续实验中，我们将通过生物学实验寻找miR-181a的靶蛋白，为胃癌的发生机制及临床生物治疗提供新的靶点。

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(编辑国荣)

Influenceofup-regulationofmiR-181aexpressiononproliferationandapoptosisofgastriccancercellAGS

YUJun-hui,SUNXue-jun,ZHENGJian-bao,WANGXiao-long,WEIGuang-bing,GAOQi,WANGKai

(DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China)

ObjectiveToinvestigatetheeffectofmiR-181aontheproliferationandapoptosisofgastriccancercellsanditspossiblemechanism.MethodsmiR-181aexpressionin5typesofgastriccancercellsandnormalgastricmucosalcelllineGES-1wasdetectedbyReal-timePCR.miR-181amimicswastransfectedtransientlyintogastriccancercelllineAGStoup-regulatetheexpressionofmiR-181a.Theinfluencesofup-regulationofmiR-181aoncellgrowth,cellcycleandapoptosiswereevaluatedbyMTTandflowcytometry.ProteinlevelsofCDC25A,cyclinA2,cyclinD1,p21,Bcl-2andBaxweredetectedbyWesternblot.ResultComparedwithGES-1,theexpressionlevelsofmiR-181aingastriccancercelllinesSGC-7901andMKN28weresignificantlyhigher(bothP<0.01),whilemiR-181ahadnosignificantdifferencesinMGC-803,BGC-823andAGS(allP>0.05).ThetransfectionofmiR-181amimicsup-regulatedmiR-181aexpressioninAGS(P<0.05).InAGScellaftertransfectionwithmiR-181aminics,theproliferativeabilitywasincreased,G0/G1phasecellratiowasdecreased,Sphasecellratiowasincreased,andapoptosisratewasreduced(allP<0.05).InmiR-181aup-regulatedAGScell,theproteinexpressionsofCDC25A,cyclinA2andBcl-2wasincreased,andtheexpressionofBaxwasdecreased(allP<0.05).ButtheexpressionsofcyclinD1andp21hadnostatisticaldifferences(bothP>0.05).ConclusionOverexpressionofmiR-181apromotescellgrowthandcellcycleinAGS;up-regulationofCDC25AandCyclinA2maybeoneofthemechanisms.OverexpressionofmiR-181ainhibitscellapoptosisinAGS,andup-regulationofBcl-2anddown-regulationofBaxmaybeinvolvedintheprocess.

miR-181a;gastriccancer;proliferation;apoptosis;cellcycle

2015-12-29

2016-03-30

国家自然科学基金资助项目(No.81101874；81172362)；陕西省科技统筹创新工程计划资助项目(No.2013KTCQ03-08)

孙学军.E-mail:sunxy@mail.xjtu.edu.cn

R735.2

A

10.7652/jdyxb201605008

SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.81101874, 81172362)andtheCoordinatedandInnovativePlanProjectsofScienceandTechnologyofShaanxiProvince(No.2013KTCQ03-08)

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160803.1148.014.html(2016-08-03)