转凝蛋白基因与胃癌及癌前病变的相关性

潘　科　张人弘　郑　娟　黄　匀　张丹丹　蒙　韬　吴小艳　赵　艳

(黔南州人民医院消化内科，贵州　都匀　558000)



·基础研究·

转凝蛋白基因与胃癌及癌前病变的相关性

潘科张人弘郑娟黄匀张丹丹蒙韬吴小艳1赵艳1

(黔南州人民医院消化内科，贵州都匀558000)

目的探讨转凝蛋白(transgelin)基因与胃癌前病变及胃癌的关系。方法收集7例慢性非萎缩性胃炎、12例肠上皮化生、4例非典型增生及39例胃癌患者的胃组织，提取及纯化总RNA。采用实时荧光定量PCR测定transgelin mRNA的表达水平，分析其与临床病理参数的关系。结果transgelin mRNA在肠上皮化生、非典型增生及胃癌组织中的表达增加，分别是慢性非萎缩性胃炎组织的4.06倍、73.11倍、13.21倍(均P<0.05)；Ⅳ期胃癌组织transgelin mRNA表达增加，是Ⅰ～Ⅱ期的2.54倍；淋巴结转移患者胃癌组织transgelin mRNA是无淋巴结转移组的3.35倍(均P<0.05)。结论transgelin基因可能与胃癌前病变的发生、发展有关，可能是胃癌发生过程中的促进因素。

胃癌前病变；转凝蛋白

转凝蛋白(transgelin)与卵巢癌〔1〕、肺癌〔2〕、直肠癌〔3〕等多种肿瘤相关，推断其可能是肿瘤发生、发展及转移的一个重要因素。有研究〔4〕发现幽门螺杆菌(H.pylori)感染致胃癌的动物模型中，胃组织中transgelin蛋白表达上调；且在体外实验研究中发现〔5〕，H.pylori感染可上调transgelin mRNA的表达。但从正常胃黏膜经慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、非典型增生，最后发展成胃癌的过程中，transgelin的水平变化并不清楚。本研究拟探讨transgelin mRNA的表达与胃癌前病变及胃癌发生、发展的关系。

1　材料与方法

1.1对象及标本采集收集2013年1月至2015年10月黔南州人民医院及同期贵州医科大学附属医院收治的经病理学确诊的82例胃癌组织标本，其中27例慢性非萎缩性胃炎(男18例、女9例，年龄32～89岁)、12例肠上皮化生(男7例、女5例，年龄30～83岁)、4例非典型增生(男3例、女1例)及39例胃癌(男24例、女15例，年龄30～82岁；胃窦癌28例、胃体癌11例；Ⅰ期2例，Ⅱ期3例，Ⅲ期14例，Ⅳ期20例；淋巴转移20例，无淋巴转移19例)。标本收集后-80℃保存备用。

1.2主要仪器及试剂DU640核酸定量仪(美国Beckman公司)，9700型PCR扩增仪、ABI Step one plus型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。琼脂糖(美国 Introvergen公司)，Trizol(美国Ameresco 公司)，MMLV逆转录酶(美国Promega 公司)，RNA 酶抑制剂、Oligo dT18、dNTPs(中国天根公司)、Power SYBR®Green PCR Master Mix(美国ABI公司)。其他试剂：焦碳酸二乙酯(DEPC)：水、乙醇、氯仿、异丙醇、氯仿-异戊醇(24∶1)均为国产分析纯。

1.3总RNA的提取及cDNA合成采用酚-氯仿一步法提取总RNA：取0.1 g组织剪碎后置于匀浆器中，加入1 ml Trizol，在冰浴中迅速匀浆30 s，充分研碎组织，置于室温5 min后加入0.2 ml氯仿，于涡旋振荡器摇振15 s，置于室温下3 min，以12 000 r/min 4℃离心15 min，吸取上清，加入0.5 ml异丙醇混匀，室温静置2 h，12 000 r/min 4℃离心15 min，弃上清，加入75%乙醇清洗，弃上清，加入无核酸水50 μl，用核酸定量仪(DU640)检测RNA浓度。

逆转录合成cDNA：参照说明书操作，在25 μl反应体系中分别加入样本RNA 3 μl、Oligo(10 pmol/L)1 μl混匀后放置于PCR仪中65℃(10 min)、4℃(10 min)后转至冰上，再加入dNTPs(10 mmol/L)2 μl、5×buffer 4 μl、RNAse Inhibitor(40 U/μl) 0.5 μl、MMLV (200 U/μl)0.5 μl，最后加DEPC处理水至25 μl，55℃孵育30 min、85℃孵育5 min、4℃孵育10 min合成cDNA，置-20℃保存。

1.4SYBR Green I实时荧光定量PCR检测transgelin基因的表达选用次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)作为内参基因，登陆GenBank获取差异蛋白基因序列，使用Primer Premier 5.0软件设计引物，由上海生工生物技术服务公司合成引物序列。实时荧光定量PCR引物序列：HPRT1上游：5'-TGAGGATTTGGAAAGGGTGT-3'，下游：5'-GAGCACACAGAGGGCTACAA-3'，产物长度118 bp，GenBank登录号：NM-000194.2；transgelin上游：5'-TGGAGATCCCAACTGGTTTATG-3'，下游：5'-CTGCCGAGGTCGTCCGTAG-3'，产物长度157 bp，GenBank登陆号：M-003186。PCR反应体系20 μl：Hotsybr Real-time PCR Master Mix(2×)10 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μl，cDNA模板(300 ng)2 μl，加DEPC补足至20 μl。PCR循环参数：95℃预变性10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。

transgelin基因和HPRT1的扩增循环荧光信号Ct值由ABI Step one plus型实时荧光定量PCR仪采集，计算transgelin基因的相对表达量(2-ΔΔCt)，其中△△Ct=实验组(Cttransgelin-CtHPRT1)-对照组(Cttransgelin-CtHPRT1)。

1.5统计学方法应用SPSS20.0软件，并对各组数据进行正态性和方差齐性检验，组间比较采用方差分析和q检验。

2　结　果

2.1RNA纯度的鉴定胃组织RNA的A260/A280值为1.8～2.0，浓度为400～800 μg/ml，1.5%琼脂糖凝胶电泳中，细胞RNA和组织RNA中的28S rRNA、18S rRNA清晰可见，表明提取的RNA质量较好。见图1。

1和4，慢性非萎缩性胃炎组；2和6，胃癌组；3，肠上皮化生组；5，非典型增生组图1　RNA琼脂糖凝胶电泳图谱

2.2transgelin mRNA在各组胃组织中的表达水平transgelin基因在肠上皮化生、非典型增生及胃癌组织中的表达增加(均P<0.05)，见表1。

表1　各组胃组织中transgelin mRNA的表达

与慢性胃炎组比较：1)P<0.05；与肠上皮化生组比较：2)P<0.05

2.3transgelin mRNA的表达与肿瘤病理特征的关系与胃癌组织Ⅰ～Ⅱ期transgelin mRNA表达水平相比，胃癌组织Ⅳ期表达明显增加；淋巴结转移患者胃癌组织transgelin mRNA表达增高(均P<0.05)，见表2。

表2　transgelin mRNA表达与胃癌患者临床病理参数的关系

与其他亚组比较：1)P<0.05

3　讨　论

transgelin 蛋白是一种重要的细胞骨架相关蛋白，不仅参与细胞骨架重构，而且还可作为信号分子参与细胞生长；也在平滑肌分化为干细胞和胚胎血管发育及细胞外基质降解和血管生成中起到重要的作用〔6〕。文献研究发现，细胞骨架结构和功能的改变与肿瘤形成和发展密切先关，是一个必不可少的重要因素，transgelin在多种肿瘤组织中表达异常，可能与肿瘤的发生、发展及转移密切相关〔7〕。

本实验发现，transgelin基因在肠上皮化生、非典型增生及胃癌组织中的表达高于慢性炎症组织，因此推测transgelin可能与胃癌的发生有关。这与Yu等〔8〕、赵艳等〔4〕研究结论一致，可能在于transgelin通过重构细胞骨架、形成伪足小体或参与上皮细胞的迁移等，对细胞的侵袭、迁移及分化起到促进作用，在胃癌的发生、发展及转移中起着重要的作用。本研究中，transgelin基因在胃癌Ⅳ期组织及已经发生淋巴转移的胃癌组织表达明显升高，也支持了上述观点。且Yu等〔8〕研究也发现trangelin蛋白可改变肿瘤微环境，促进胃癌细胞迁移和入侵。有研究发也现，transgelin在缺氧的肺癌细胞中高表达，使用小型干扰RNA，可减少迁移能力〔9〕；且在胰腺癌患者中已发生淋巴转移者transgelin 表达明显上调，因此推断transgelin与淋巴转移密切相关，且transgelin可能是晚期胰腺癌新的预后标志物〔10〕。Lee等〔11〕研究发现，transgelin在肿瘤细胞中表达量显著高于非肿瘤细胞，是非肿瘤细胞的25倍，并可对肿瘤干细胞的迁移和入侵起促进作用。另外，翁永强等〔12〕研究发现，高转移肝癌细胞的树突细胞组transgelin的表达显著高于正常的树突细胞组。以上研究都说明transgelin基因在某些肿瘤发生、发展和转移过程中有重要作用，但有研究发现，在人乳腺癌、结肠癌〔13〕及卵巢浆液性癌〔1〕等研究中均发现，transgelin水平均下降，甚至在卵巢交界性浆液性瘤、卵巢浆液性癌的早期发生过程中，transgelin基因表达减弱或无表达，且Goctinck等〔14〕研究认为transgelin可能抑制肿瘤细胞的迁移和浸润。因此，对于不同肿瘤transgelin 表达差异的具体机制也需进一步研究。

1刘志辉.Transgelin基因与蛋白在卵巢浆液性肿瘤中的表达及临床意义〔D〕.沈阳：中国医科大学，2005.

2刘艳茹.Transgelin基因在肺腺癌发展中的作用研究〔D〕.杭州：浙江大学，2014.

3李里，彭佳远，马延磊，等.Transgelin蛋白在人结直肠癌中的表达及其临床意义〔J〕.肿瘤，2009；29(8)：765-7.

4赵艳，谢渊，陈娴，等.幽门螺杆菌感染蒙古沙鼠胃癌模型的建立及蛋白质组学研究〔J〕.中华病理学杂志，2014；43(11)：1-7.

5赵艳，谢渊，王文玲，等.transgelin基因在幽门螺杆菌感染胃癌细胞及人胃癌组织中的表达〔J〕.临床检验杂志，2014；32(12)：920-2.

6白霞，张连峰，周琳，等.靶向干扰骨架蛋白Transgelin抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生长〔J〕.中华普通外科杂志，2013；28(7)：538-41.

7刘志辉，王敏，史春雪，等.Transgelin基因在卵巢浆液性肿瘤中的表达〔J〕.中国现代医学杂志，2010；20(19)：2933-6.

8 Yu B，Chen X，Li J，etal.Stromal fibroblasts in the microenvironment of gastric carcinomas promote tumor metastasis via upregulating TAGLN expression〔J〕.BMC Cell Biol,2013；14：17.

9 Wu X，Dong L，Zhang R，etal.Transgelin overexpression in lung adenocarcinoma is associated with tumor progression〔J〕.Int J Mol Med，2014；34(2)：585-91.

10 Zhou L，Zhang R，Zhang L，etal.Upregulation of transgelin is an independent factor predictive of poor prognosis in patients with advanced pancreatic cancer〔J〕.Cancer Sci，2013；104(4)：423-30.

11 Lee EK，Han GY，Park HW，etal.Transgelin promotes migration and invasion of cancer stem cells〔J〕.J Proteome Res，2010；9(10)：5108-17.

12翁永强，袁祖荣，张益军，等.负载肝癌细胞裂解物的树突状细胞Transgelin表达水平与其功能的关系〔J〕.中华肝脏病杂志，2008；16(7)：514-8.

13 Shields JM，Rogers-Graham K,Der CJ.Loss of transgelin in breast and colon tumors and in RIE-1 cells by Ras deregulation of gene expression through Raf-independent pathways〔J〕.Biol Chem，2002；277(12)：9790-9.

14 Goctinck S，Watcrston RH.The caenorhabditis elegans muscle-affecting gene uric-87 encodesa novel thin filament-associated protein〔J〕.J Cell Biol，1994；127(1)：79-93.

〔2016-02-11修回〕

(编辑袁左鸣)

国家自然科学基金(81260303)；贵州省科技攻关计划项目(黔科合SY字〔2011〕3067号)；黔南州社会发展科技计划(黔南科合社字〔2012〕13号)；贵州省科技合作计划项目(黔科合LH字〔2015〕7360)

赵艳(1973-)，女，副教授，硕士，主要从事肿瘤分子生物学研究。

潘科(1974-)，男，副主任医师，硕士，主要从事消化道肿瘤的发病机制研究。

R735

A

1005-9202(2016)16-3869-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.001

1贵州医科大学分子生物学重点实验室