结缔组织生长因子对大鼠血管外膜成纤维细胞增殖作用的影响

李　军，罗丽敏，董　晓，徐　霞，路　丹，彭　芬，党书毅*



结缔组织生长因子对大鼠血管外膜成纤维细胞增殖作用的影响

李军1,4，罗丽敏2，董晓1，徐霞3，路丹4，彭芬4，党书毅1*

目的研究血管活性因子结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)对大鼠血管外膜成纤维细胞(Adventitial fibroblasts，AFs)增殖作用的影响和细胞内信号转导机制。方法离体培养AFs并作鉴定，采用CCK-8技术确定CTGF促AFs增殖作用的效应浓度，在CTGF效应浓度下加入不同的细胞内信号转导阻断剂，观察哪种信号通路参与CTGF促AFs的增殖效应。结果采用组织贴块法可以培养出AFs，经免疫荧光检测培养的细胞为AFs，CTGF以浓度依赖方式促进AFs增殖，CTGF促AFs增殖的效应能被Rho激酶阻断剂Y-27632、钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)阻断剂环孢菌素A(Cyclosporine A,CSA)和钙通道阻断剂尼卡地平所阻断。结论贴块法能成功培养出AFs；CTGF是可以促进AFs增殖的趋化因子，其促进增殖效应可能通过CaN、Rho以及Ca2+通路来介导。

结缔组织生长因子；细胞增殖；CCK-8；信号转导

0　引言

血管外膜在血管重构的发生、发展过程中起到了重要的作用，是多种心血管疾病发病的结构基础，针对血管外膜的研究是当前心血管领域研究热点之一[1]。血管外膜成纤维细胞(Adventitial fibroblasts，AFs)是血管外膜的主要组成部分，其在体内血管活性物质作用下，通过分泌活性因子，参与细胞表型转化、增殖、凋亡、迁移及胶原的合成和分泌，从而参与血管的功能调节和修复过程[2]。AFs已成为治疗心血管疾病的新靶点。结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)是一种生物学效应广泛的血管活性物质，能促进血管生成、细胞趋化及诱导细胞外基质生成[3]，但CTGF对血管外膜介导的血管重构是否起作用，能否促进AFs增殖及其相应机制目前知之甚少。本实验在体外培养的AFs上，采用CCK-8等技术手段，以观察CTGF对AFs增殖作用的影响，并初步探讨其相应的细胞内信号转导机制。

1　材料与方法

1.1主要试剂DMEM/F12培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；免疫组化用小鼠抗大鼠α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白，α-smooth muscle actin)和Vimentin单克隆抗体购自武汉博士德公司，CCK-8试剂盒购自碧云天生物科技公司；CTGF为美国Prospec公司产品；Y-27632、CSA、Nicardipine、H-7和PD98059等信号通路阻断剂为biochemical公司产品，其余为市售分析纯试剂。

1.2血管外膜成纤维细胞的原代培养和消化传代取雄性SD大鼠，断颈处死后立刻浸泡于75%酒精中5 min，开胸取胸主动脉，无菌条件下转移至超净工作台。用眼科剪将血管纵向剖开，使内膜面向上，用眼科弯镊自上而下轻轻刮除内膜后，再小心撕下近内膜面的中膜平滑肌层，剩余的絮状乳白色组织即为血管外膜。将其转移入含有20%胎牛血清的DMEM/12培养基中，剪成约1 mm3小块，吸除多余的培养基，使用灭菌巴氏吸管将小块吸出，并均匀平铺在25 cm2培养瓶的底部。轻轻翻转培养瓶使瓶底向上，向培养瓶中加入约6 mL含20% FBS的DMEM/F12培养基。将培养瓶置入37 ℃、含5% CO2细胞培养箱中直立静置2 h后，慢慢翻转培养瓶，使培养液缓慢覆盖组织块，并防止组织块漂落在培养基中，继续置于培养箱中培养，约72 h后，可见AFs自组织块周围爬出。此时，向培养瓶中补加3 mL含20% FBS的DMEM/F12培养基，以保证细胞生长所需的养分。2～3 d后，待细胞达70%～80%融合状态时，即可按1∶4传代。取2～3代细胞进一步实验。

1.3外膜成纤维细胞的鉴定将AFs传至24孔板中，待细胞生长至50%融合状态时，倒掉培养液，使用PBS冲洗3遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS冲洗3 min×3次，用含0.3% Triton X-100、1%BSA的PBS透化处理10 min，PBS冲洗3 min×3次，加封闭血清室温封闭60 min后，倒掉封闭血清，加小鼠抗大鼠α-SM-actin抗体及波形蛋白Vimentin抗体，37 ℃孵育2 h，PBS冲洗3 min×3次，滴加FITC标记的山羊抗小鼠，避光孵育60 min，倒置荧光显微镜下观察结果，拍片。

1.4CCK-8试剂盒检测细胞增殖取处于对数生长期、生长状态良好的AFs，用含10% FBS的DMEM/12培养基调整细胞密度至5×103个/100 μL，接入96孔板，每孔100 μL细胞悬液，同时设空白组，37 ℃培养过夜(在细胞孔周围孔内加入100 μL无菌PBS)；根据不同分组和细胞处理设置分别处理细胞，每组5个复孔，37 ℃培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃培养4 h，酶标仪测定各孔吸光值(OD450)。

1.5实验设计和分组

1.5.1不同浓度CTGF对AFs增殖的影响实验分为6组：1组为对照组，不加CTGF；2～6组为不同浓度的CTGF组(CTGF 1、2、5、10、20 ng/mL)。

1.5.2不同信号途径阻断剂对CTGF效应的影响实验分为5组：①对照组：仅加不含血清的DMEM/F12培养基；②CTGF组：只加CTGF，浓度为10 ng/mL，下同；③CTGF+尼卡地平(Nicardipine，10-6mol/L)组；④CTGF+环孢菌素(CSA，10-5mol/L)组；⑤CTGF+PD98059(10-5mol/L)组；⑥CTGF+Y-27632(10-5mol/L)组；⑦CTGF+H-7(10-5mol/L)组。

2　结果

2.1AFs的原代培养血管外膜组织块在含20% FBS的DMEM/F12培养基中培养72 h后，可见梭型的AFs自组织块周围爬出(图1)。为避免温度、pH值等变化对细胞生长的影响，暂不换液，仅向培养瓶中补加3 mL新鲜培养基，以保证细胞生长所需的养分。约2～4 d后，细胞可达亚融合状态(图2)。

图1　AFs原代培养(100×)

图2　AFs亚融合状态(100×)

2.2AFs的鉴定在24孔板中，待AFs长至50%融合状态时，固定细胞，加入α-SM-actin抗体及波形蛋白Vimentin一抗抗体孵育后，再滴加FITC标记的二抗，倒置荧光显微镜下观察、拍片。可见α-SM-actin在AFs中基本没有表达(图3A)，而vimentin在AFs中高表达(图3B)，证实培养的细胞为AFs。

图3　AFs免疫组化鉴定(200×)

2.3不同浓度CTGF对AFs增殖的影响(n=5)使用不同浓度的CTGF(0、1、2、5、10、20 ng/mL)刺激AFs 24 h后，CTGF以浓度依赖方式刺激AFs增殖。与对照组相比，在5 ng/mL浓度时，CTGF促AFs的增殖效应具有统计学意义(P<0.05)，在10 ng/mL的浓度时，促增殖作用达到最大效应(P<0.05)。见图4。

图4　CTGF促AFs增殖效应的浓度曲线(n=5)

2.4不同信号通路阻断剂对CTGF刺激AFs增殖的影响(n=5)使用CTGF(10 ng/mL)刺激AFs 24 h，同时加入不同信号通路阻断剂与CTGF(10 ng/mL)共培养，结果发现，CTGF促AFs的增殖作用与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；与CTGF组相比，CTGF+Y-27632组、CTGF+CSA组和CTGF+Nicardipine组的OD值明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示CTGF促AFs增殖效应能够被Y-27632、CSA和Nicardipine所抑制。CTGF+PD98059、CTGF+H-7组与CTGF组相比差异无统计学意义，说明CTGF促AFs增殖效应与PD98059和H-7无关。见图5。

图5　CTGF促AFs增殖的相关信号通路(n=5)

3　讨论

血管壁由内膜、中膜和外膜组成，血管内膜和中膜在心血管系统疾病中的作用已经被充分证实，而血管外膜过去长期被认为只起到营养中膜以及血管支持作用。但越来越多的证据表明，血管外膜不仅仅是血管壁的一层支持结构，还可以通过和血管壁其他成分复杂的交互效应来发挥作用，是高血压、动脉粥样硬化、血管再狭窄等血管重构性疾病的病变起始部位[4]。

AFs是血管外膜的主要成分，AFs在多种作用机制下增殖、迁移、活化，发生表型转化，细胞内持续表达α-SMA，转化成肌成纤维细胞(Myofibroblast，MFB)[5]。MFB具有较强的分泌功能和收缩特性，分泌大量炎症介质和生长因子，参与血管的功能调节和修复过程。该过程受多种肽类活性因子的调控，但其具体机制尚未完全阐明。我们前期的研究发现，尾加压素Ⅱ(UrotensinⅡ，UⅡ)可以浓度依赖方式促进AFs表达α-SMA，向肌成纤维细胞表形转化，并促进成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原及细胞迁移。这些作用可以通过促有丝分裂蛋白激酶MAPK、钙调神经磷酸酶、Rho以及PKC、钙通道等途径来实现[6]。CTGF作为一种效应广泛的血管活性肽，在离体培养的AFs上是否具有促增殖作用，以及通过何种信号通路起作用是本研究的重点。

CTGF于1988年首先在小鼠实验研究中被发现[7]，此后在筛选人脐静脉血管内皮细胞cDNA文库时分离得到[8]，可由成纤维细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、多能干细胞及某些肿瘤细胞分泌合成[9]，广泛表达于心脏、肝、肾脏等多种组织和器官。CTGF的生物学效应广泛，能刺激细胞增殖和凋亡、迁移和分化[9-11]；而CTGF在血管外膜中的作用机制目前尚不明确。

本研究在体外培养的AFs中，发现CTGF以浓度依赖性的方式促进AFs增殖，CTGF促AFs增殖的效应能被Rho激酶阻断剂Y-27632、钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)阻断剂环孢菌素A(CyclosporineA,CSA)和钙通道阻断剂尼卡地平所阻断。提示CTGF具有促进AFs增殖作用，该作用可能通过Ca2+、CaN以及Rho激酶等多条途径来实现。而PD98059和H-7两种通路抑制剂，对CTGF的促增殖作用没有影响，提示MAPK和PKC两条通路未参与到CTGF的促增殖效应中。

AFs活性增加，表型转化，发生增殖反应是血管重构的重要环节，在高血压、冠心病以及血管损伤后再狭窄的发生发展过程中具有十分重要的意义，因此，CTGF对AFs的这种促增殖效应高度重视。本试验提示，CTGF可以诱导AFs增殖，并且与Ca2+、CaN以及Rho激酶等通路相关，提示CTGF是一种新的AFs活性刺激剂，可通过旁分泌方式来实现与其他生物活性因子之间的调节过程。由于生物活性物质之间的调控网络是机体维持血管自稳态的重要物质基础，而CTGF在血管重构性疾病中对AFs的调控作用在心血管疾病的发生、发展及恢复过程中具有重要作用，提示CTGF也可以作为心血管疾病治疗的新靶点。

本研究的局限性为仅仅从旁分泌的角度进行了CTGF功能的初步探讨，且受实验条件的限制，未对Ca2+、CaN以及Rho激酶调控的下游环节进行研究。对于CTGF对AFs效应各通路间的相互关系、主要途径的Cross-Talking尚待进一步深入研究。

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Effect of CTGF on proliferation of rat adventitial fibroblasts

LI Jun1,4,LUO Li-min2,DONG Xiao1,XU Xia3,LU Dan4,PENG Fen4,DANG Shu-yi1*

(1.Department of Cardiology,Shiyan Taihe Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;2.Department of Dermatology,the First Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China;3.2013 Undergraduate Class of Pharmacy College,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;4.Department of Cardiology,the First Hospital of Peking University,Beijing 100034,China)

Objective To study the effect of vasoactive connective tissue growth factor (CTGF) on adventitial fibroblasts (AFs) proliferation and explore the mechanism of signal transduction.MethodsAFsinvitrowere cultured and cellular components were identified;CCK-8 technology was used to observe the effect of CTGF on proliferation of AFs;different intracellular signal transduction inhibitors were added to observe which signaling pathways involved in the proliferation effect of CTGF on AFs.ResultsThe cells cultured by explant patch method were identified as AFs by immunofluorescence assay.CTGF promoted AFs proliferation in a concentration dependent manner.CTGF′s promoting effect on the proliferation of AFS could be blocked by Rho kinase blocking agent Y-27632,calcineurin blocking agent cyclosporine A (CSA) and calcium channel blocker nicardipine.ConclusionAFs can be successfully cultured by the explant patch method,and CTGF can promote the proliferation of AFs,which may promote the proliferation effect through CaN,Rho and Ca2+pathway.

Connective tissue growth factor;Proliferation;CCK-8;Signal transduction

2016-03-18

1.湖北医药学院附属太和医院心内科，湖北 十堰 442000；2.中国医科大学附属第一医院皮肤科，沈阳 110001；3.湖北医药学院药学院2013级本科班，湖北 十堰 442000；4.北京大学第一医院心内科，北京 100034

湖北省科技厅项目(2011CDC049)；十堰市科技局研究项目(14Y17)；十堰市太和医院国家自然科学基金培育项目(2014PY03)

10.14053/j.cnki.ppcr.201609004