异体羊膜间充质干细胞移植治疗初发1型糖尿病的安全性和有效性

张新, 徐亮, 周玉红,白云

(辽河油田总医院, 辽宁盘锦 1240102)



异体羊膜间充质干细胞移植治疗初发1型糖尿病的安全性和有效性

张新, 徐亮, 周玉红,白云

(辽河油田总医院, 辽宁盘锦 1240102)

目的 对初发1型糖尿病患者进行异体羊膜间充质干细胞(ADMSCs)移植治疗，评估该方法的安全有效性。方法 培养ADMSCs，并对细胞生物活性进行鉴定。将符合纳入标准的33例患者随机分为对照组17例和治疗组16例，对照组接受常规治疗，治疗组接受ADMSCs移植联合常规治疗。检测患者治疗前和治疗后6、12、24个月的空腹C肽(FC-P)、空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2 h PG)、FC-P与血糖比值(CPGR)、糖化血红蛋白(HbA1c)和胰岛素，并观察不良反应情况。结果 培养的ADMSCs生物活性良好，符合临床应用标准。治疗后6个月，治疗组除FC-P外其余各项观察指标与治疗前相比差异均有统计学意义(P均<0.05)；且治疗组2 h PG和胰岛素与对照组相比明显减少(P均<0.05)。治疗后12个月，治疗组除HbA1c外其余各项观察指标与该组治疗前相比差异均有统计学意义(P均<0.05)；治疗组各项观察指标与对照组相比，除FPG外差异均具有统计学意义(P均<0.05)。治疗后24个月，对照组FPG与治疗前相比明显降低，HbA1c和胰岛素明显升高(P均<0.05)；治疗组各项观察指标与治疗前相比差异均具有统计学意义(P均<0.05)；治疗组各项观察指标与对照组相比，除FPG外差异均具有统计学意义(P均<0.01)。治疗组在干细胞治疗过程中无明显不良反应。结论 ADMSCs移植可以有效治疗初发1型糖尿病，且安全性好。

1型糖尿病；异体羊膜间充质干细胞；移植；安全性；有效性

1型糖尿病是由T细胞介导的胰岛β细胞选择性破坏导致的器官特异性自身免疫病[1]。1型糖尿病的发病过程是隐匿性的，待到临床确诊时已经有60%～80%的胰岛细胞团被破坏，因此保护胰岛细胞是治疗1型糖尿病的首要目标[2,3]。目前临床上的主要治疗方式为使用胰岛素注射或结合免疫抑制剂，但这种治疗方式不能很好地保护患者的胰岛功能和延缓并发症的发生[4]。研究证明，采用低免疫源性的间充质干细胞移植方法治疗1型糖尿病，可通过调节胰岛的自身免疫反应，诱导胰岛细胞再生，恢复患者的胰岛功能[3～5]。2012年1月～2014年1月,本研究对初发1型糖尿病患者进行异体羊膜间充质干细胞(ADMSCs)移植，取得较好疗效。现报告如下。

1　资料与方法

1.1 临床资料初发1型糖尿病患者33例，符合1999年WHO对糖尿病的诊断和分型标准。男19例、女14例，年龄13～35岁，病程小于1年。排除患有肿瘤等恶性消耗性疾病；严重肝肾等功能不全；合并其他内分泌系统疾病；有精神疾病或依从性差等影响试验完成者；HIV、HBV等感染；妊娠或哺乳期妇女；超敏体质者。随机分为对照组和治疗组。治疗组男9例、女7例，年龄(22.1±6.6)岁，病程(3.5±2.9)个月，BMI(20.8±1.9)kg/m2，糖尿病酮症酸中毒(DKA)10例(62.5%)，谷氨酸脱羟酶抗体(GADA)阳性11例(68.8%)；对照组男10例、女7例，年龄(21.6±6.8)岁，病程(3.7±5.5)个月，BMI(21.1±1.9)kg/m2，DKA 11例(64.7%)，GADA阳性12例(70.6)。两组性别、年龄、病程、BMI、DKA发生率和GADA阳性率相比差异均无统计学意义(P均>0.05)。

1.2ADMSCs制备、生物活性鉴定 ADMSCs的制备：取健康足月胎儿羊膜，用盐水洗净后剪碎，使用Ⅰ型胶原酶(Gibco)消化后离心。再将收集到的单核细胞使用无血清培养液(Gibco)贴壁培养，每隔48 h换液，待细胞达到80%至90%融合时按1∶3进行传代。经胶原酶消化法得到的细胞接种12 h后可逐渐出现贴壁细胞，2～3 d后贴壁的细胞逐渐增多，且贴壁的细胞伸展成长梭形。接种3 d后弃去未贴壁的红细胞，剩余贴壁的细胞主要为ADMSCs。1周后培养瓶中的细胞为成纤维细胞样，散在生长，少部分呈集落状。传代培养的ADMSCs增殖能力强，形态更趋于一致、排列整齐，为旋涡状鱼群样排列。生物活性鉴定：将状态较好的第4代ADMSCs种于96孔板中，在种板后第1、2、3、5、7天使用MTT法检测细胞活性，之后绘制细胞生长曲线。从生长曲线中可以看出，ADMSCs细胞在种板后2 d内处在潜伏期，在第3～5天处在对数生长期，在第5～7天进入平台期，此时细胞增殖速度减慢。因此建议ADMSCs传代周期应该为5 d。用成脂和成软骨诱导液诱导培养后，分别用油红O和阿尔新兰染色，之后使用光镜拍照。结果显示，ADMSCs成脂诱导10～14 d后，细胞从长梭形逐渐变为较圆的多角形，并且细胞内出现光镜下可见的小脂滴呈葡萄状，随着诱导时间的延长，脂滴逐渐融合增大，油红O染色后显红色。成软骨诱导16～20 d后，细胞可被阿尔新兰染成蓝色。经检测第4代的ADMSCs细胞呈CD90、CD73、CD105阳性，且阳性率高于97%；呈CD34、CD45和HLA-DR阴性，并且阴性率低于2%。经台盼兰染色检测，用于移植的ADMSCs细胞的成活率均高于96%。经鲎试剂法检测，用于移植的ADMSCs细胞的内毒素均低于5 EU/mL。

1.3治疗方法对照组行常规治疗，每日监测血糖至少4次，根据血糖水平调整饮食和运动方案，规律使用胰岛素，年龄较大者可增加二甲双胍和葡萄糖苷酶抑制类药物。治疗组在常规治疗基础上进行ADMSCs移植。将第5至第8代细胞用无动物源成分的胰酶(Gibco)消化成单细胞悬液，离心后用生理盐水重悬，按1×107/kg体质量进行静脉回输，患者移植后留院观察4 h以上。

1.4主要观察指标记录移植前患者的性别、年龄、病程、身高、体质量、有无DKA和GADA阳性情况。移植前和移植后6、12、24个月检测患者的空腹C肽(FC-P)、空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2 h PG)、FC-P与血糖比值(CPGR)、糖化血红蛋白(HbA1c)、胰岛素(Insulin)。记录移植后和随访过程中患者的不良反应。

2　结果

2.1两组不同时间FC-P、FPG、2 h PG、CPGR、HbA1c、Insulin比较见表1。

2.2不良反应在治疗和随访过程中，患者未出现高热、感染等过敏反应或其他严重不良反应。

3　讨论

1型糖尿病患者的胰岛功能严重受损，自身分泌能力下降决定了其只能依靠外源性的胰岛素控制血糖，而以这种方式控制血糖会造成血糖较大幅度的波动，进而损伤患者机体其他器官功能[6]。1型糖尿病的患者年龄大多小于35岁，终生需要使用胰岛素治疗，严重影响患者的生活质量，因此迫切需要能恢复胰岛功能的新治疗方式出现。近年来，间充质干细胞以其较好的临床研究效果越来越受到人们的关注。间充质干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的成体干细胞。它具有较强的免疫调节功能，可抑制反应性T淋巴细胞的增殖，减少T细胞对胰岛β细胞的损伤作用[5],还可通过使Th1向Th2细胞转化，增加调节性T细胞的数量[7]等途径诱导1型糖尿病患者机体的免疫耐受。本研究通过使用较易采集培养，分化和增殖能力较强的ADMSCs移植治疗1型糖尿病，评估ADMSCs治疗1型糖尿病的临床疗效和安全性，为临床应用提供依据。

表1　两组不同时间FC-P、FPG、2 h PG、CPGR、HbA1c、Insulin比较

注：与本组治疗前相比，#P<0.05,##P<0.01；与对照组同时间相比，*P<0.05,**P<0.01。

1型糖尿病主要病理机制是T细胞介导的自身免疫性疾病，主要特征是胰岛β细胞被破坏，从而导致胰岛素分泌不足，因此阻止患者胰岛的自身免疫反应，同时最大程度地恢复胰岛功能，是治疗1型糖尿病的理想方案。总结以往的研究得出间充质干细胞治疗1型糖尿病可能主要通过以下机制：①调节机体免疫功能，保护未受损的胰岛细胞[7]；②促进体内胰岛β细胞的再生；③诱导胰腺干细胞分化为胰岛β细胞[8]；④分化为胰岛样细胞等。目前，间充质干细胞治疗1型糖尿病的具体机制还需进一步探索研究。

本文中ADMSCs的细胞表型、成活率、内毒素的检测结果说明培养的ADMSCs具有较好的生物学活性，并且无菌、无支原体，符合成体干细胞的临床应用标准。本研究利用间充质干细胞的“归巢”特性，使用经静脉回输的方法，期望能获得Hu等[5]研究中脐带间充质干细胞在较长时间内促进胰岛β细胞功能恢复的临床效果。结果显示，在1型糖尿病患者的血糖控制方面，ADMSCs联合常规治疗与仅使用常规治疗相比优势明显。对照组和治疗组患者的HbA1c、FC-P和CPGR的变化表明ADMSCs联合常规治疗能明显促进患者胰岛β细胞分泌功能的恢复。以上结果说明，ADMSCs移植可有效治疗1型糖尿病。在治疗和随访过程中未发现与细胞移植相关的严重不良反应，说明ADMSCs移植治疗1型糖尿病安全性好。

由于本研究纳入的患者例数有限，随访时间不够长，因此ADMSCS治疗初发1型糖尿病的疗效和安全性还需大样本临床试验进行验证。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.015

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