反相高效液相色谱峰法测定痛风颗粒中落新妇苷的含量

肖　柳，杨全伟

1.武汉市中医医院(湖北 武汉430022) 2.武汉市第一医院药学部(湖北 武汉 430022)



反相高效液相色谱峰法测定痛风颗粒中落新妇苷的含量

肖柳1，杨全伟2*

1.武汉市中医医院(湖北 武汉430022) 2.武汉市第一医院药学部(湖北 武汉 430022)

目的建立测定痛风颗粒中的落新妇苷含量的方法。方法采用高效液相色谱法。流动相为甲醇-0.1%磷酸(40∶60)，检测波长为290nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL。结果落新妇苷进样量在0.099 8-0.998 0μg(R=0.999 9)范围内与峰面积线性关系良好；精密度试验、重复性试验、稳定性试验的RSD≤3.0%；平均加样回收率为101.54%，RSD=0.54%(n=6)。结论该方法测量较为准确、稳定、简便，可用于痛风颗粒的质量控制。

痛风颗粒；落新妇苷；高效液相色谱法

高尿酸血症主要是由于尿酸合成增加或排泄减少，是机体嘌呤代谢异常所引发的临床疾病，临床目前对其发病原因尚不能完全统一，但大多数患者均伴有肥胖、高血压、高血脂等疾病。随着人们生活水平的不断提升，该疾病的临床发病率不断上升[1]。同时呈现出地域性、性别及饮食结构差异，随着病情发展，关节腔处会有尿酸堆积形成尿酸盐结晶，引发炎症因子活动，从而形成一系列临床症状。现代医学主要选用促进尿酸排泄的药物(如苯溴马隆)或抑制尿酸合成的药物(别嘌醇)，具有一定的副作用，且对于合并高脂血症者，往往需要加用调脂药物，在加重患者经济负担的同时，进一步降低患者的依从性[2]。因此，研究高效低毒的既能降尿酸又能调节脂代谢的药物已经迫在眉睫。近年来，越来越多研究表明中医药治疗高尿酸血症合并高脂血症具有独特的优势[3]。痛风颗粒为武汉市中医医院应用多年证实具有良好降尿酸作用的临床经验方，由土茯苓、白英、薏苡仁、徐长卿等十一味中药组成，以土茯苓等作为君药，根据文献，落新妇苷为二氢黄酮类化合物，是土茯苓中主要有效成分[4-5]。具有淡渗利湿、健脾祛浊、通脉补肾等功效。主治由高尿酸血症引起的痛风尤其是合并有高脂血症如关节肿痛，头昏头重，肢体困倦乏力，脘腹闷胀，腰膝酸软，大便粘腻。本实验主要应用高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)对痛风颗粒中落新妇苷含量进行测定，以期为制剂质量控制提供有效依据。

1　仪器与试剂

Waters2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Waters2489紫外检测器(美国Waters公司)。百万分之一天平(METTLERTOLEDO)(美国奥豪斯公司)。落新妇苷对照品(中国食品药品检定院，批号111798-201504)；痛风颗粒(医院自制制剂，批号20150614)；蒸馏水，甲醇、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件检测波长的选择：适量称取落新妇苷对照品，加50%甲醇溶解后进行过滤，配制成浓度为10μg/mL的溶液；根据2015版《中国药典》中的相关规定[6-7]，紫外分光光度法进行全波长扫描，测定结果显示，最大吸收波长为290nm，因此本次试验以290nm作为检测波长。Waterse2685C18色谱柱(5μm，4.6×250mm)；流动相为甲醇：0.1%磷酸(40∶60)；检测波长290nm；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量10μL。

2.2溶液配制

2.2.1对照品溶液配制精密称定4.990mg落新妇苷对照品。加入50%甲醇溶液稀释至50mL，充分振荡摇匀，溶液浓度为0.099 8mg/mL。

2.2.2供试品溶液配制取痛风颗粒0.5g，加入50%甲醇50mL溶液，称重，超声溶解30min，放冷，补重，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液的配制称取不含土茯苓的白英、薏苡仁、徐长卿等十味药材，按照“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.3专属性试验取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样测定。结果按上述含量测定方法，供试品中落新妇苷的色谱峰能够较好的分离，保留时间与对照品一致，且阴性样品在相同保留时间无色谱峰出现，表明该色谱条件专属性良好，见图1、图2、图3。

图1　落新妇苷对照品HPLC图谱

图2　痛风颗粒供试品HPLC图谱

图3　阴性对照HPLC图谱

2.4线性关系考察精密量取落新妇苷对照品溶液1、2、4、6、8、10mL，用50%甲醇溶液定容至10mL容量瓶，分别制备成浓度为0.009 98mg/mL，0.019 96mg/mL，0.039 92mg/mL，0.059 88mg/mL，0.079 84mg/mL，0.099 8mg/mL的溶液。精密吸取10μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。其中横坐标为落新妇苷进样量(X)，纵坐标为峰面积(Y)，进行线性回归计算，得到线性方程：Y=2 336 982X-114 709，相关系数R=0.999 9。根据线性回归方程分析可得，落新妇苷在0.099 8-0.998μg的浓度范围内线性关系良好，见图4。

图4　落新妇苷进样量与峰面积线性关系

2.5精密度试验精密吸取10μL对照品溶液，按照上述色谱条件进行进样测定，连续进样6次，测定峰面积，RSD=0.53%，表明仪器精密度良好。

2.6重复性试验分别适量称取6份供试品(批号20150614)，根据上述供试品溶液制定方法，进行测定，外标法计算本品平均含量=0.039 2mg/mL，RSD为1.21%，表明方法重复性良好。

2.7稳定性试验精密吸取供试品溶液，于0、1、2、4、8、12h分别进样，根据上述色谱条件测定其峰面积，计算结果显示峰面积RSD为0.69%，结果表明供试品溶液中所含落新妇苷在12h内稳定性良好。

2.8加样回收率试验精密量取已知含量的痛风颗粒(批号20150614)各0.25g，共6份，置具塞锥形瓶中，依次精密加入落新妇苷对照品(0.040 9mg/mL)10mL，测定加样回收率，见表1。计算分析可得，平均加样回收率为101.54% ，RSD=0.54% ，结果显示本试验方法加样回收率良好。

表1　加样回收率结果

2.9样品含量测定取3批痛风颗粒(批号20150615；20150616；20150617)，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按照“2.1”项下含量测定方法测定落新妇苷的含量，见表2。

表2　样品含量测定结果

3　讨论

临床研究发现，落新妇苷具有较为显著的选择性免疫抑制作用，能够有效选择性诱导移植排斥反应中活化T细胞的凋亡，可作为一种新型的免疫抑制剂用于临床推广。此外落新妇苷还具有抗氧化、体外抗菌、抗水肿、镇痛等作用，其中落新妇苷具有较强抗氧化能力，对机体内DPPH、ABTS等超氧离子及自由基均具有良好清除作用，有学者指出[11-13]其能够抑制髓过氧化物酶的活性，清除次氯酸，落新妇苷能够增加机体抗氧化能力从而起到降尿酸作用。2015版《中国药典》中明确指出，落新妇苷属于难溶物质，不易被机体吸收，生物利用度较差，因此限制了其在临床上的应用，为更好的对其进行推广，在保证药品质量优良的前提下对制药工艺进行优化。本次试验研究证明在290nm处落新妇苷有最大吸收波长，因此设定为检测波长，关于流动相选择上，在考察不同比例的甲醇-水作为流动相洗脱时发现，落新妇苷拖尾现象较为明显，最终发现以甲醇：0.1%磷酸(40∶60)作为流动相，其基线平稳，落新妇苷与杂峰具有较好的分离度，且无明显拖尾现象。本研究发现此方法测定落新妇苷含量准确，方便，稳定，可用于痛风颗粒的有效成分落新妇苷的检测，弥补了痛风颗粒的质量控制标准中含量测定的空白，从而在生产环节保障痛风颗粒的有效性和稳定性，保证患者用药的安全与有效[11-12]。

[1]张娴,孙维峰,侯燕,等.复方土茯苓颗粒治疗高尿酸血症40例随机对照临床观察[J].中医杂志,2016,1(57):41-45.

[2]徐硕,尚明英,刘广学.高效液相色谱法测定土茯苓药材中7种活性成分的含量[J].中国中药杂志,2015,40(3):469-479.

[3]刘佳,李玲.高尿酸血症的发病机制与药物治疗研究进展[J].国际药学研究杂志,2010,37(1):24-28.

[4]张笑颜,詹丽茵,曾祥腾，等.高效液相色谱法测定不同产地土茯苓药材中落新妇苷的含量[J].中国医药导报,2010,7(10):90-91.

[5]曾瑞鑫,赵钟祥,林朝展,等.HPLC法测定过岗龙中落新妇苷的含量[J].中国药师,2012,15(6):762-764.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:17-18.

[7]邵丰,温成平,丁兴红，等.基于RPLC技术测定祛浊通痹方中落新妇苷含量[J].中国中医药信息杂志,2012,19(2):47-48.

[8]TangJ,GuoJ,FanJ,etal.MetaboliteprofilingofastilbininratserausingUPLC/MSEandimpactofitsmetabolitesonimmunosuppressiveactivity[J].Journalofchromatography,B.Analyticaltechnologiesinthebiomedicalandlifesciences,2013(929):56-62.

[9]黄敬群,朱妙章,王四旺,等.染料木素、芹菜素、槲皮素、芦丁和落新妇苷对高尿酸血症小鼠黄嘌呤氧化酶活性及血清尿酸水平的影响[J].中国药理学通报,2011,27(4):561-565.

[10]方婧,付梅红,杨洪军,等.微波协助提取在中药饮片含量测定中的应用——微波法与药典法测定土茯苓中落新妇苷含量比较[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(24):43-45.

[11]张白嘉,刘亚欧,刘榴,等.土茯苓及落新妇苷抗炎、镇痛、利尿作用研究[J].中药药理与临床,2004,20(1):11.

[12]CaiY，ChenT,XuQ.Astilbinsuppressescollagen-inducedarthritisviathedysfunctuinoflymphocutes[J].Inflammres,2003(52):334.

责任编辑：艾茜

TheGoutGranuleTestedforAstilbinContentbyReversedPhaseHighPerformanceLiquidChromatographicPeakMethod

XiaoLiu1，YangQuanwei2*

(1.Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430022,China;2.Department of Pharmacy,the First Hospital of Wuhan,Wuhan 430022,China)

ObjectiveToexploreamethodtotestAstilbiningoutgranule.MethodsThehighperformanceliquidchromatographymethod(HPLC)wasusedtomeasuremobilephaseofmethanol-0.1%phosphoricacid(40∶60),wavelengthf290nm,theflowrateof1.0mL/min,columntemperatureof30℃andsamplequantityof10μL.ResultsTheAstilbinsamplequantity(between0.099 8-0.998 0μg,R=0.999 9)hadagoodlinearrelationshipwithpeakarea.TheRSDintheaccuracy,repeatabilityandstabilitytestwere3.0%orless.Theaveragesamplerecoveryratewas101.54%. (RSD=0.54% n=6).ConclusionThismethodwasmoreaccurate,stableandsimple.Itcanbeusedforqualitycontrolofgoutgranule.

goutgranule;astilbin;HPLC

肖柳(1986- )，女，湖北黄冈人，硕士，中医师，研究方向：中西医结合肿瘤研究；*

杨全伟，男，硕士，中药师，主要从事中药新药方面的研究。

R284.1

A

1008-8164(2016)03-0046-03

2016-06-10