siRNA下调Gli基因表达对食管鳞癌KYSE-30细胞生物学行为的影响

王　雷，杜媛鲲，刘庆熠，米　源，廖海江，王　娜，王　林

（河北医科大学1.第四医院胸二科，石家庄050011；2.期刊社，石家庄050017；3.第四医院分子生物学研究室，石家庄050011）



siRNA下调Gli基因表达对食管鳞癌KYSE-30细胞生物学行为的影响

王雷1，杜媛鲲2，刘庆熠1，米源1，廖海江1，王娜3，王林1

（河北医科大学1.第四医院胸二科，石家庄050011；2.期刊社，石家庄050017；3.第四医院分子生物学研究室，石家庄050011）

目的探讨Gli表达下调对食管鳞癌KYSE-30细胞周期分布和上皮-间质转化能力的影响及其分子机制。方法将Gli1和Gli2 siRNA和空白对照siRNA分别转染KYSE-30细胞48 h，实时荧光定量PCR法检测Gli1、Gli2 mRNA表达水平；Western blot法检测KYSE-30细胞Gli1、Gli2、Cyclin D1、Cyclin D2、p21、波形蛋白（Vimentin）和β-catenin蛋白的表达；流式细胞术检测KYSE-30细胞周期分布；Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果与空白对照siRNA组相比，Gli1和Gli2 siRNA可明显抑制KYSE-30细胞Gli1、Gli2mRNA和蛋白表达，下调Cyclin D1、Cyclin D2、Vimentin和β-catenin蛋白的表达和增加p21蛋白表达，将细胞周期阻滞在G0/G1期并降低细胞的侵袭能力，差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论Gli蛋白表达可能在食管鳞癌的发生发展中具有重要作用，下调Gli1和Gli2表达可导致食管鳞癌细胞增殖、细胞周期分布和上皮-间质转化能力的改变，这可能与Cyclin D1、Cyclin D2、p21、Vimentin和β-catenin蛋白变化相关。

食管鳞癌；Gli；细胞周期；上皮-间质转化

食管癌在全世界范围内发病率和病死率分别排在第8位和第6位［1］，其中我国食管癌的发病率居世界首位，传统的手术和放化疗并没有显著提高患者的长期生存率。近年来肿瘤的基因治疗作为一种新的替代方法在肿瘤治疗中显示出良好的应用前景，其中RNA干扰作为一种全新的治疗模式被公认为可以调节细胞基因表达。

近年来研究发现Hedgehog（Hh）信号传导通路在非霍奇金淋巴瘤［2］、肺癌［3］、肝癌［4］和前列腺癌［5］等多种肿瘤组织中异常激活，与恶性肿瘤的异常增殖和侵袭转移密切相关。目前国内外针对食管鳞癌组织中Hh下游通路的核心成分Gli1和Gli2的靶向治疗未见报道，因此，本研究应用特异性的Gli1和Gli2 siRNA下调食管鳞癌KYSE-30细胞中Gli1和Gli2的表达，研究其表达下调对食管癌细胞周期以及上皮-间质转化能力的影响并探讨其机制，旨在为食管鳞癌的分子靶向治疗提供新依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系来源：人食管鳞癌细胞系KYSE-30购自英国Sigma-Aldrich公司。

1.1.2主要仪器及试剂：SilencerTMSelect Gli1和Gli2 siRNA购自美国Life Technologies公司，RPMI1640培养液购自美国Gibco公司，Ham培养液购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Gemini公司，总RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司，iScriptTMcDNA合成试剂盒购自美国Bio-Rad公司，TaqMan®基因表达预混液购自美国Applied Biosystems公司，TaqMan®Gli1引物和探针（Hs00171790），Gli2引物和探针（Hs01119974_m1）和GAPDH（Hs02758991_g1）购自美国Life Technologies公司，Pierce-BCA蛋白分析试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，Gli1兔抗人多克隆抗体、Cyclin D1兔抗人单克隆抗体和Cyclin D2兔抗人单克隆抗体均购自美国Cell Signaling公司，Gli2鼠抗人单克隆抗体和p21鼠抗人单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，β-catenin鼠抗人单克隆抗体和波形蛋白（Vimentin）兔抗人单克隆抗体均购自美国Abcam公司，GAPDH鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗购自美国Fisher Scientific公司，ECL化学发光试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，matrigel胶和Transwell膜嵌套购自美国Corning公司，Lipofectamine™RNAiMAX转染试剂购自美国Thermofisher Scientific公司；Epics-XL型流式细胞仪购自美国Beckman-Coulter公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和转染：食管鳞癌细胞系KYSE-30细胞于37℃、5%CO2，含2%胎牛血清和青-链霉素各100mg/mL的Ham和RPMI 1640培养基（1∶1）培养传代。选取对数生长期的细胞以每孔3×105个细胞接种至于6孔板上，培养24 h后待细胞密度达到50%～60%，更换无血清培养基并按照Lipofectamine™RNAiMAX转染试剂说明书进行Gli1和Gli2 siRNA干扰引物的转染，同时设立空白对照组（Control SiRNA）。每组各设2个孔，每孔Gli1和Gli2 siRNA及空白对照siRNA的浓度均为100 nmol/L。转染6 h后更换新的无血清培养基。转染48 h后提取各组样本的mRNA及蛋白，实验重复3次。

1.2.2实时荧光定量PCR检测Gli1和Gli2基因的表达：用PBS洗涤转染48 h后的6孔板细胞。（1）总RNA的提取，按照总RNA提取试剂盒说明书提取各组样本RNA，采用NanoDrop 8000全光谱紫外-可见光分光光度计测定每组样本的RNA浓度。（2）cDNA合成，按照cDNA合成试剂盒说明书进行cDNA的反转录，每组样本的反应体系为40μL，包含总RNA 500 ng，iScript逆转录酶2μL和iScript反应混合液8μL，反转录条件为25℃5 min，42℃30 min和85℃5 min。（3）PCR扩增，将cDNA用无RNase水稀释10倍，按照10μL/孔的反应体系将每组样本cDNA 4.5μL、Taqman基因表达预混液5μL以及TaqMan®Gli1、Gli2、GAPDH各自的引物和探针0.5μL加样在384孔板，置于ABI 7900 HT高通量荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，扩增条件为95℃10 s；60℃10 s；72℃10 s；40个循环。以GAPDH的CT值作为内参，采用2-∆Ct法进行各组样本分析。

1.2.3Western blot检测蛋白表达：用PBS洗涤转染48 h后的6孔板细胞，每孔加含有蛋白酶抑制剂的M-PER细胞总蛋白提取试剂100μL，用刮匙收集各组样本的总蛋白提取液，BCA法测定测定各组样本的总蛋白浓度。采用常规Western blot法蛋白上样进行凝胶电泳和转PVDF膜。转膜成功后用5%脱脂奶粉的TBST液封膜，加入一抗Gli1（工作浓度为1∶1 000），一抗Gli2（工作浓度为1∶250），一抗Cyclin D1（工作浓度为1∶1 000），一抗Cyclin D2（工作浓度为1∶1 000），一抗p21（工作浓度为1∶250），一抗Vimentin（工作浓度为1∶5 000），一抗GAPDH（工作浓度为1∶10 000）和一抗β-catenin（工作浓度为1∶2 000），于4℃摇床过夜孵育。第2天TBST液洗膜3次，每次10 min，加入羊抗兔或羊抗鼠二抗（工作浓度均为1∶20 000）室温孵育1 h，将膜置于ECL试剂发光5 min，暗室曝光显影，最后通过Image软件对显影的蛋白条带进行灰度值分析。以GAPDH为内参，每组样本的蛋白相对表达等于目的蛋白表达量与内参蛋白表达量的比值。实验重复3次。

1.2.4流式细胞术检测KYSE-30细胞周期：收集转染48 h后的KYSE-30细胞制备成单细胞悬液，以PBS漂洗后置4℃70%冰乙醇固定30 min。调整每组样品的细胞数为1×106/0.1 m L，冷PBS漂洗3次，加入50 μg/mL碘化吡啶1 mL，4℃冰箱染色30 min后上机捡测DNA含量，采用MuticycleAV分析软件对DNA细胞周期进行拟合分析。实验重复3次。

1.2.5Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力：将Matrigel胶用培养基按1∶4稀释后，取50μL包被Transwell小室基底膜，37℃放置2 h待Matrigel胶凝固成凝胶。上室中分别加入Gli1和Gli2 siRNA和control siRNA转染的7.5×104个细胞，在下室中加入含10%胎牛血清的培养液500μL，5%CO2、37℃培养箱内培养。24 h后弃上室液体，用棉签擦去Matrigel胶和未侵袭的细胞，将小室基底膜用甲醛固定和结晶紫染色，倒置显微镜（×400）下观察。每张膜随机取4个视野，计数每个视野内的穿膜细胞数，计算平均值。

1.3统计学分析

2　结果

2.1实时荧光定量PCR结果（图1）

将Gli1&Gli2 siRNA组检测数据与对照组（control siRNA）数据经标准化处理后显示：Gli1& Gli2 siRNA组Gli1mRNA表达水平为0.55±0.09，较对照组1.00±0.06显著降低，差异有统计学意义（t= 7.188，P=0.002）；Gli2 mRNA表达水平为0.34± 0.05，较对照组（1.00±0.03）显著降低，差异有统计学意义（t=18.804，P＜0.001）。

2.2Western blot检测蛋白表达

应用Image软件测量蛋白条带灰度值的方法分别检测KYSE-30细胞Gli1、Gli2、Cyclin D1、Cyclin D2、p21、Vimentin和β-catenin蛋白表达：结果显示Gli1&Gli2 siRNA组Gli1（t=13.141，P＜0.001）、Gli2（t=25.384，P＜0.001）、Cyclin D1（t=11.631，P＜0.001）、Cyclin D2（t=9.029，P=0.001）、Vimentin（t=41.503，P＜0.001）和β-catenin（t=7.578，P= 0.002）蛋白表达较空白对照组（control siRNA）显著减少，差异有统计学意义；Gli1&Gli2 siRNA组较空白对照组（control siRNA）增加p21蛋白表达（t= -12.267，P＜0.001），差异有统计学意义。见图2。

2.3流式细胞术检测细胞周期结果

图1　实时荧光定量PCR法检测不同siRNA处理KYSE-30细胞的G li1、G li2 m RNA水平Fig.1　The Gli1 and Gli2 m RNA level after treated by different siRNA as detected by real time PCR in KYSE-30 cells

图2　Western blo t方法检测KYSE-30细胞中G li1、G li2、Cyclin D1、Cyclin D2、p21、Vim en tin和β-catenin蛋白表达Fig.2　The Gli1，G li2，Cyc lin D1，Cyclin D2，p21，Vim entin and β-ca ten in protein expression of KYSE-30 cells by Western b lot assay

流式细胞术检测结果显示：Gli1&Gli2 siRNA组G0/G1期细胞为（64.33±2.52）%，与空白对照si RNA组［（46.67±2.08）%］比较显著增高（t=-9.369，P=0.001）；S期细胞为（32.53±1.50）%，与空白对照siRNA组［（51.17±1.76）%］比较显著降低（t= 13.971，P＜0.001），见图3。

图3　流式细胞术检测siRNA作用KYSE-30细胞周期组方图Fig.3　The cell cycle of KYSE-30 cells after treated by d ifferen t siRNA detected by flow cytom etry

2.4Transwell侵袭实验

与空白对照组（control siRNA）穿膜细胞数（142±9.82）相比，Gli1&Gli2 siRNA组穿膜细胞数（56±6.84）明显减少，差异有统计学意义（t= 17.566，P＜0.001），见图4。

图4　Transwe ll实验检测siRNA对KYSE-30细胞侵袭能力的影响Fig.4　The e ffect on KYSE-30 cell invasion ability with siRNA by transwe ll assay

3　讨论

我国是全球食管癌发病率最高的国家，每年新发病例占全球近一半。大部分患者就诊时已到中晚期，即使近年来新技术和新药物不断涌现，但食管癌复发率和病死率并未有明显改善，主要原因在于没有找到合适的治疗靶点。因此，探寻参与食管癌发生、发展的主要因子和信号通路对食管癌的防治及预后具有重要的临床意义。

转录因子往往是影响肿瘤生物学特性的关键基因，其活性一旦发生改变，肿瘤细胞的多个信号通路及相应的生物学特征都会发生改变，因此转录因子往往是肿瘤治疗的重要靶点。Hh信号通路异常激活和肿瘤的发生关系密切，其中核转录因子Gli作为Hh信号通路的关键组分包括Gli1、Gli2和Gli3。Gli3是该通路的转录抑制因子，而Gli1和Gli2作为主要的转录激活因子在多种肿瘤中异常高表达且参与调控下游多种靶基因的表达，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用［6-7］。本研究结果显示，转染Gli1、Gli2 siRNA 48 h后的食管癌KYSE-30细胞中内源性Gli1、Gli2mRNA和蛋白表达均显著下调，明显低于空白siRNA对照组，提示特异性的Gli1、Gli2 siRNA能有效下调食管癌细胞中内源性Gli1、Gli2的表达。

肿瘤发生的本质是细胞周期被异常调控，引起细胞周期加快造成细胞过度增殖，因此细胞周期紊乱与肿瘤的发生密切相关。本研究采取流式细胞术检测转染Gli1、Gli2 siRNA后KYSE-30细胞周期分布的变化，结果显示Gli1、Gli2 siRNA转染组G0/G1期细胞的比例显著高于空白siRNA对照组，而S期细胞的比例显著低于空白siRNA对照组，提示Gli1、Gli2表达水平下降可以促使食管癌细胞周期静止在G0/G1期并降低S期细胞的比例，从而阻断DNA复制导致细胞增殖受到抑制。SRIVASTAVA等［8］应用Gli1和Gli2特异性抑制剂GANT61对多种横纹肌肉瘤细胞和移植瘤进行体内外抗肿瘤研究，结果发现Gli1和Gli2在多种横纹肌肉瘤细胞过表达，GANT61可以通过下调Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin D3、CyclinE和上调p21表达对细胞周期进行调控从而抑制肿瘤增殖。目前国内外关于食管鳞癌Hh/Gli信号通路与细胞周期蛋白Cyclin D和p21关系的研究未见报道，本研究采用Western blot检测发现在Gli1、Gli2表达沉默后Cyclin D1和Cyclin D2蛋白表达下调，p21蛋白表达升高，因为Cyclin D1和Cyclin D2是重要的细胞周期调控因子。它们都通过与周期素依赖性蛋白激酶结合来实现对细胞周期正性调控，在癌组织中过表达可增强其恶性表型并与高病死率有关，而p21可以抑制周期素依赖性蛋白激酶活性从而负性调控细胞增殖［9-10］。本研究结果提示Hh/ Gli信号通路激活后诱导细胞恶性转化的途径之一可能是通过上调Cyclin D1、Cyclin D2和下调p21促进细胞增殖来实现的，从而为临床上应用Gli抑制剂来抑制肿瘤细胞增殖提供实验依据。

细胞异常增殖癌变的另一个严重后果是上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）即上皮细胞在形态学上发生向间质细胞表型转变的生物学过程，导致上皮来源的肿瘤细胞极性消失和获得了侵袭迁移能力，因此EMT是肿瘤转移的重要的分子基础［11］。Vimentin是公认的重要EMT指标，其高表达可以降低细胞表面上皮钙黏素的数量和干扰上皮钙黏素介导的细胞黏附，导致良性肿瘤迅速演变为高侵袭性转移性肿瘤，在肿瘤的发生发展转移中发挥重要作用［12］。β-Catenin过表达也被认为是EMT重要标记物之一，并且有研究［13-14］表明肺癌组织中Gli1和β-Catenin高表达呈正相关，应用重组Shh蛋白激活Hh通路后可以促进肿瘤的侵袭与转移。此外BEHNSAWY等［15］研究发现Hh信号通路的活化可以促进肾癌细胞EMT进程，而应用Hh通路抑制剂cyclopamine可以下调EMT，认为Hh-EMT信号传导可能在肾癌的发生发展中起着重要作用。本研究Western blot实验表明，随着Gli1和Gli2表达的抑制，EMT相关蛋白Vimentin和β-Catenin表达下调，Transwell实验进一步显示在Gli1、Gli2表达沉默后穿过Transwell小室的食管癌细胞数明显减少，证明了Gli可能通过诱导EMT过程促进食管鳞癌细胞的侵袭转移，敲掉Gli1和Gli2基因可以抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭能力。

综上所述，Gli可以通过调控靶基因的表达促进食管鳞癌生长转移，Gli有望作为一种新的肿瘤标志物为食管鳞癌的治疗提供有效的靶点，对于其调控食管鳞癌生物学行为的分子机制以及如何开展临床应用还有待进一步探索。

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（编辑于溪）

Effects of Gli Silencing with Small Interfering RNA on the Malignant Biological Behavior of Esophageal Squamous Carcinoma KYSE-30 Cells

WANG Lei1，DU Yuankun2，LIU Qingyi1，MI Yuan1，LIAO Haijiang1，WANG Na3，WANG Lin1
（1.Department of Thoracic Surgery，The Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Periodical Magazine，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；3.Department of Molecular Biology，The Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China）

Objective To detect the expression of Gli in esophageal squamous carcinoma，and to analyze the effects of down-regulation of Gli expression on malignant biological behavior of esophageal squamous carcinoma KYSE-30 cells，so as to explore their molecular mechanisms.Methods Gli1，Gli2 siRNA and control siRNA were transfected into KYSE-30 cells for 48 h，respectively.The mRNA expression of Gli 1 and Gli 2 were detected by real time fluorescence quantitative PCR method.The protein expression of Gli 1，Gli 2，Cyclin D1，Cyclin D2，p21，Vimentin and β-catenin were observed by Western blot assay.The cell cycle were determined by flow cytometry.Transwell chambers were adopted to detect invasion ability.Results Compared with control siRNA，Gli1&Gli2 siRNA could inhibit the mRNA and protein expression of Gli1，Gli2 in KYSE-30 cells，which down-regulate the protein expression of Cyclin D1，Cyclin D2，Vimentin，β-catenin，and enhance p21 expression.Downregulation of Gli1，Gli2 could arrest cell cycle at G0/G1phase and reduce cell invasion ability（P＜0.01）.Conclusion Gli may play orchestral role in the development of esophageal squamous carcinoma.The down-regulation of Gli expression can lead to changes in the proliferation，cell cycle and invasion of esophageal squamous carcinoma，which may be associated with Cyclin D1，Cyclin D2，p21，Vimentin and β-catenin proteins.

esophageal squamous carcinoma；Gli；cell cycle；epithelial-mesenchymal transition

R734.2

A

0258-4646（2016）10-0918-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.10.013

河北省科技厅科技计划（132077127D）；河北省卫生厅医学科学研究重点课题（20160177）

王雷（1976-），男，主任医师，博士.

E-mail：yuankundu@163.com

2016-01-19

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