钙调蛋白的N末端和C末端片段载体构建和蛋白制备

邵冬雪，孙嘉瑶，杜　逸，李　墨，唐子鉴，于佳慧，胡慧媛，孙雪菲，孙胜男，郝丽英

（中国医科大学药学院药物毒理教研室，沈阳110122）



钙调蛋白的N末端和C末端片段载体构建和蛋白制备

邵冬雪，孙嘉瑶，杜逸，李墨，唐子鉴，于佳慧，胡慧媛，孙雪菲，孙胜男，郝丽英

（中国医科大学药学院药物毒理教研室，沈阳110122）

目的构建钙调蛋白（CaM）的N末端片段（N-lobe）、C末端片段（C-lobe）及其钙离子（Ca2+）结合位点突变体（N-lobe12，C-lobe34）原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定。方法将上述cDNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞，异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达。利用Glutathione-Sepharose 4B beads进行分离纯化。采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量，Bradford方法测定纯化后蛋白浓度，GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性。结果蛋白高表达，纯化后获得高纯度、高浓度目的蛋白，纯化后蛋白能与Cav1.2型钙通道结合并可恢复已“rundown”心肌细胞膜钙通道的活性。结论本研究成功构建可以表达生物活性蛋白的N-lobe、C-lobe、N-lobe12及C-lobe34原核表达载体，为深入研究CaM的生物学功能奠定了基础。

钙调蛋白；N末端片段；C末端片段；突变体；pull-down；膜片钳

钙调蛋白（calmodulin，CaM）是广泛存在于真核细胞内的最为重要的钙离子（Ca2+）结合蛋白，而Ca2+作为细胞内重要的第二信使参与许多细胞过程的调控，CaM通过与Ca2+结合而调节细胞内Ca2+浓度，从而广泛参与机体各种生理功能的调节［1-2］。

CaM的外形类似哑铃，有2个相似的被定义为EF-hand结构（N-lobe和C-lobe）的球形末端，中间被1个螺旋结构相连，每个EF-hand结构有2个Ca2+结构域，每个结构域可以结合1个Ca2+，即1个CaM可以结合4个Ca2+。在非刺激细胞中CaM与Ca2+结合的亲和力很低，主要以无钙离子结合钙调蛋白（apocalmodulin，ApoCaM）的形式存在，而当刺激因素使细胞中Ca2+浓度升高时，Ca2+和CaM就会结合形成钙——钙调蛋白复合物（Ca2+-CaM），引起CaM构型变化，继而改变CaM与许多效应物结合的亲和力［3-4］。CaM两端结构域有48%的相同序列和75%的同源序列，二者碳链骨架也极为相似。然而两端的不同序列也决定了它们功能的特异性，首先对Ca2+的亲和力不同：其中C-lobe与Ca2+的亲和力是N-lobe的10倍［5］；其次C-lobe和N-lobe对靶蛋白展现了不同的亲和力［6-7］，例如，在Cav1.2钙通道，Ca2+/C-lobe展现了高亲和力，而Ca2+/N-lobe展现了中低等的亲和力［8］。

早期研究［9-10］发现，CaM可直接与Cav1.2钙通道α1亚单位的C末端（CT1）和N末端（NT）结合，并且CaM和ATP能够恢复run-down的L-型钙通道的活性，但CaM是通过其N-lobe或C-lobe单独结合到钙通道起作用，还是需要C-lobe和N-lobe同时存在，仍有待进一步阐明。因此，本研究制备了具有生物活性的N-lobe和C-lobe 2个蛋白片段，以及钙调位点突变的N-lobe12和C-lobe34无钙lobe模型，为进一步探讨N-lobe和C-lobe功能特异性提供了材料基础。

1　材料与方法

1.1材料

pGEX-6p-3/N-lobe及pGEX-6p-3/C-lobe质粒由日本鹿儿岛大学Kameyama教授惠赠，pGEX-6p-3/N-lobe12（E31A+E67A）及pGEX-6p-3/C-lobe34（S101F+E140A）质粒由上海生工生物工程有限公司合成，氨苄西林（ampicillin，AMP）、异丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、溶菌酶（lysozyme，LYS）、二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）均购自Sigma公司，PreScission Protease及Glutathione-Sepharose 4B beads（GS-4B beads）购自GE Healthcare公司，其他试剂均购自BIOSHARP公司。

1.2BL21感受态细胞的转化

分别取10 ng pGEX-6p-3/N-lobe、pGEX-6p-3/C-lobe、pGEX-6p-3/N-lobe12及pGEX-6p-3/C-lobe34加入100μL大肠杆菌BL21，冰中放置30 min，置于42℃水浴精确热击60 s，然后快速转移至冰中冷却2 min。加入37℃预温好的SOC培养基1 mL，37℃摇震荡培养1 h（160r/min），4 000r/min离心2 min，吸除部分上清培养液，剩余约200μL培养液重悬菌体，涂布含AMP 0.1mg/mL的琼脂平板培养基，37℃过夜培养。

1.3质粒的提取

挑取经琼脂平板培养基筛选后的单克隆菌种，接种于4 mL含AMP 0.05mg/mL的LB液体培养液中，37℃、120r/min震摇培养12～16 h。取菌液1.5 m L（其余用20%甘油冻存于-20℃冰箱以保留菌种），5 000r/min离心5 min，弃尽上清。加冰预冷的碱裂解液Ⅰ300μL剧烈涡旋震荡至沉淀均匀重悬，加新配制的碱裂解液Ⅱ300μL混匀至透明，加冰预冷的碱裂解液Ⅲ350μL混匀至内容物分散均匀，置于冰上3～5 min至出现白色沉淀。15 000r/min、4℃离心10 min后取上清与等量体积的酚：氯仿振荡混合，15 000r/min、4℃离心2 min后取上清与2倍体积量的无水乙醇振荡混合，室温放置2 min。15 000r/min、4℃离心10 min后弃上清，沉淀的核酸中加70%乙醇1 mL清洗，15 000r/min、4℃离心2 min后室温干燥10～15 min至乙醇完全挥发。用含RNaseA（20 μg/mL）的灭菌水重新溶解核酸，温和振荡数秒钟，取部分再次稀释一定比例后，测质粒DNA吸光度（A）值，稀释到500 ng/μL，其余部分于-20℃冰箱保存。

1.4质粒的鉴定

1.4.1酶切鉴定：重组质粒具有NotⅠ、BstBⅠ及EcoRⅠ限制性酶切位点，pGEX-6p-3/N-lobe和pGEX-6p-3/C-lobe选用EcoRⅠ酶切，pGEX-6p-3/N-lobe12和pGEX-6p-3/C-lobe34选用NotⅠ和BstBⅠ双酶切后，进行琼脂糖电泳鉴定。

1.4.2测序鉴定：将冷冻保存的菌液送公司进行DNA测序，测序结果用BLAST分析同源性。

1.5蛋白表达及纯化

1.5.1蛋白表达：取适量菌种加入装有400 mL LB（含AMP 50 μg/mL）培养液的锥形瓶中，37°C、120r/min震摇培养12～16 h。当A595值在0.6～1.0时，加入IPTG至1 mmol/L，37℃、120r/min震摇培养4 h，诱导融合蛋白表达。

1.5.2蛋白纯化：所有操作均在冰上进行，所有离心均为4°C离心。取400 m L菌液5 000r/min离心10 min后弃上清，用20 mL PBS重悬沉淀菌体，加入溶菌酶至1 g/L，冰浴30 min。200 W超声20 min打破菌体（超声3 s停7 s），16 000r/min离心10 min，取上清与两管300μL GS-4B beads（预先用PBS洗2次）混合后置10r/min的旋转培养器室温孵育1 h。600r/min离心3 min后弃上清，洗5次后每管加入495μL PBS和5μL PreScission Protease，混匀后置水平摇床室温剧烈震摇5 h。600r/min，离心3 min，取上清即目的蛋白于-80℃冻存。常规15%SDSPAGE电泳检测纯化后的蛋白纯度及相对分子量。参照Bradford蛋白浓度测定试剂盒方法测定纯化后的蛋白浓度。

1.6蛋白活性鉴定

1.6.1Pull-down方法检测蛋白结合活性：取连接于beads上的NT 50μL于2 mL的EP管中，加入10 μmol/L的N-lobe（C-lobe、N-lobe12、C-lobe34）及含2 mmol/L［Ca2+］的Tris buffer至300μL。液体中游离［Ca2+］经WEBMAXC v2.10软件计算获得。将2 mL EP放于旋转培养器上，10r/min，4°C，4 h。600r/min，3 min，弃上清。含2 mmol/L［Ca2+］的Tris buffer轻洗2次，beads用15μL 1×SDS样品缓冲液洗脱，上清加于15%SDS-PAGE电泳确认［11］，检测lobe蛋白是否仍具有结合活性。

1.6.2Patch-clamp方法检测蛋白生理活性：应用膜片钳单通道记录模式监测钙通道活性。检测N-lobe、C-lobe、N-lobe12、C-lobe34对“run-down”Cav1.2钙通道的恢复作用［12］。

2　结果

2.1重组质粒的酶切鉴定

质粒pGEX-6p-3大小为4 983 bp，经SalⅠ/XhoⅠ酶切插入N-lobe基因序列（240 bp），经BamHⅠ/NotⅠ酶切插入C-lobe（219 bp），N-lobe12（240 bp）及C-lobe34（219 bp）基因序列。进行琼脂糖电泳鉴定质粒，pGEX-6p-3/N-lobe和pGEX-6p-3/C-lobe选用EcoRⅠ酶切，pGEX-6p-3/N-lobe12和pGEX-6p-3/C-lobe34选用NotⅠ和BstBⅠ双酶切。质粒pGEX-6p-3第963号碱基开始为SalⅠ酶切位点，968号碱基开始为XhoⅠ酶切位点，945号碱基开始为BamHⅠ酶切位点，973号碱基开始为NotⅠ酶切位点，953号碱基开始为EcoRⅠ酶切位点，954号碱基开始为BstBⅠ酶切位点；N-lobe第31号碱基开始为ECoRⅠ酶切位点。故重组pGEX-6p-3/N-lobe质粒全长：4 983-（968-963）+240=5 218 bp，经EcoRⅠ酶切后得：2个碱基片段，分别为963-953+30=40 bp及5 218-40= 5 178 bp，其中因40 bp碱基片段太小，酶切经琼脂糖凝胶电泳后丢失，琼脂糖凝胶电泳图上只在大约5 200 bp出现条带（图1A）；重组pGEX-6p-3/C-lobe质粒全长：4 983-（973-945）+219=5 174 bp，C-lobe上没有ECoRⅠ，经EcoRⅠ酶切后得到1个5 173 bp大片段（图1A）；pGEX-6p-3/N-lobe12质粒全长4 983-（973-945）+240=5 195 bp，经NotⅠ和BstBⅠ双酶切后有2个片段，分别为973-654-（973-945）+240= 531 bp及5 195-531=4 664 bp（图1B）；pGEX-6p-3/C-lobe34质粒全长：4 983-（973-945）+219=5 174 bp，经NotⅠ和BstBⅠ双酶切后有2个片段，分别为973-654-（973-945）+219=510 bp及5 195-510=4 685 bp（图1C）。

图1　重组质粒的酶切鉴定琼脂糖电泳图Fig.1　Agarose electrophoresis of recombination plasmids digested by restriction endonuclease

2.2重组质粒的测序鉴定

碱基测序结果如图2所示，红色标记的碱基为突变位点。根据测得的碱基序列及3个碱基决定1个氨基酸的原则，获得N-lobe，C-lobe氨基酸顺序（图3）。其中方框内的为钙结合位点，共4个钙结合位点，每个钙结合位点由12个氨基酸组成；红色标记的氨基酸为突变位点。碱基测序结果与BLAST软件比对，N-lobe和C-lobe测序结果与Homo sapiens calmodulin 2（CALM2）完全一致（图2A）；N-lobe12在CALM2基因序列的第163、271个碱基由A突变成C（图2），相对应的第31、67个氨基酸残基均由E突变成A（图3）；C-lobe34在CALM2基因序列的第372个碱基由A突变成T、第373个碱基由G突变成T、第490个碱基由A突变成C（图2），其中前2个碱基的共同突变使其相对应第101个氨基酸残基由S突变成F，最后1个碱基的突变使其相对应的第140个氨基酸残基由E突变成A（图3）。测序结果进一步证明重组质粒构建成功。

图2　重组质粒的DNA测序鉴定Fig.2　The DNA sequence identification of recombination plasm ids

图3　N-lobe和C-lobe氨基酸序列图Fig.3　The am ino acid sequence of N-and C-lobe

2.3纯化后蛋白纯度和浓度测定

N-lobe、C-lobe及其突变体蛋白表观分子量约为9×103，纯化后蛋白经15%SDS-PAGE电泳，结果如图4显示，条带位置与预期结果一致，且杂带较少即纯度较高、表达量大，经上述鉴定，初步认为提纯获得N-lobe、C-lobe、N-lobe12和C-lobe34蛋白。

采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒方法测定提纯蛋白浓度，其中N-lobe浓度为0.46 g/L；N-lobe12浓度为0.44 g/L；C-lobe浓度为0.82 g/L；C-lobe34浓度为0.78 g/L。

2.4纯化后蛋白的活性鉴定

GST pull-down结果如图5所示，纯化后的N-lobe、C-lobe、N-lobe12和C-lobe34在2 mmol/L［Ca2+］下均可与NT结合，且C-lobe的结合最显著，N-lobe次之，N-lobe12和C-lobe34较弱。Patch Clamp结果显示纯化后蛋白均可恢复已run-down的心肌钙通道活性。以上结果说明本研究纯化后得到的蛋白均具有生物活性。

图4　纯化后N-lobe，C-lobe，N-lobe12and C-lobe34蛋白SDS-PAGE图Fig.4　SDS-PAGE of purification N-lobe，C-lobe，N-lobe12and C-lobe34

图5　N-lobe，C-lobe，N-lobe12和C-lobe34蛋白与GST-NT结合的SDS-PAGE图Fig.5　SDS-PAGE of N-lobe，C-lobe，N-lobe12and C-lobe34binding with GST-NT

3　讨论

CaM是一种广泛存在于生物体的钙结合蛋白，研究［11-15］表明CaM通过结合到Cavs的α1亚型的N末端及C末端而介导了Ca2+依赖性易化（Ca2+-dependent facilitation，CDF）和Ca2+依赖性失活（Ca2+-dependent inactivation，CDI）。

研究［16-19］表明CaM的C-lobe和N-lobe可以单独调节通道的CDF和CDI，Ca2+结合到CaM的N-lobe和C-lobe引起不同的调节，C-lobe介导L型钙通道（Cav1.x）CDI，而介导非L型钙通道（Cav2.x）CDF［19］。但前期研究［11，14］在用膜片钳方法观察CaM的钙结合位点突变体对CaV1.2易化和失活作用时发现通道的Ca2+依赖性调节需要CaM的C-lobe和N-lobe同时存在。除了C-lobe和N-lobe在功能上的不同，对于Cavs钙通道上的各个CaM结合位点也展现了不同的亲和力。例如，在Cav1.2钙通道，Ca2+/C-lobe展现了高亲和力，而Ca2+/N-lobe展现了中低等的亲和力［8］。因此，关于CaM的lobe特异性地调节CDF和CDI的机制有待进一步阐明。

以上研究均以突变CaM的1、2位钙结合位点模拟C-lobe模型，以突变CaM的3、4位钙结合位点模拟N-lobe模型，因有研究［20］表明无钙CaM（ApoCaM）亦可调节通道开放，考虑到1、2位钙结合位点突变丧失钙结合能力后的N末端或3、4位钙结合位点突变丧失钙结合能力后的C末端仍可能存在生物活性，本研究制备CaM的两端蛋白片段而非在完整结构CaM基础上突变钙结合位点来模拟N-lobe及C-lobe模型。本研究质粒构建并转化成功，蛋白高表达，纯化后蛋白高纯度、高浓度并且具有结合活性及电生理活性，为后续研究CaM 2个lobe的功能特异性奠定了基础。

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（编辑于溪）

Vector Construction and Protein Preparation of N-and C-term inal Lobe of Calmodulin

SHAO Dongxue，SUN Jiayao，DU Yi，LI Mo，TANG Zijian，YU Jiahui，HU Huiyuan，SUN Xuefei，SUN Shengnan，HAO Liying
（Department of Pharmaceutical Toxicology，Pharmacy College，China Medical University，Shenyang 110122，China）

Objective To establish prokaryotic expression vectors for the expression，purification and activity identification of N-terminal lobe（N-lobe），C-terminal lobe（C-lobe）of calmodulin（CaM）and their Ca2+-insensitive mutants（N-lobe12，C-lobe34）GST fusion protein.Methods cDNAs of N-lobe，C-lobe and their mutants were individually ligated into pGEX-6p-3 plasmid vector，and then transformed into Escherichia coli BL21 component cells.The bacteria were incubated，and induced with IPTG before harvesting.The corresponding peptides were expressed as glutathione-S-transferase（GST）fusion proteins and purified using Glutathione Sepharose 4B beads.The GST regions of N-lobe，C-lobe and their corresponding mutants were cleaved with PreScission Protease.SDS-PAGE was used to detect the purity and relative molecular weight.Bradford method was used to determine the concentration.The protein activity was determined by pull-down assay and patch-clamp technique.Results SDSPAGE confirmed the recombinant lobes of CaM with high purity，and high concentrations of CaM had been successfully purified.Individual N-lobe，C-lobe and their mutants could bind to N-terminal tails of Cav1.2（NT）and rescue the channel activity from run-down in ventricular myocytes of guinea-pig heart.Conclusion The prokaryotic expression vectors for the expressions of N-lobe，C-lobe and their mutants have been successfully established，which provides the basis for further researches on biological functions of CaM.

calmodulin；N-lobe；C-lobe；mutants；pull-down；patch-clamp

R96

A

0258-4646（2016）10-0877-06

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.10.003

国家自然科学基金（31471091）；大学生创新训练项目（2015023，201610159000052，201610159000107）

邵冬雪（1987-），女，讲师，博士.

郝丽英，E-mail：lyhao@mail.cmu.edu.cn

2016-01-19

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