鸡新城疫-禽流感二联灭活疫苗免疫不同日龄商品肉鸡的效果比较

江兴华　赵华娥　林晓荣　郑敬敏　包松英　林拱阳　王全溪（.福州大北农生物技术有限公司福州35004；2.福建农林大学动物科学学院福州350002）

鸡新城疫-禽流感二联灭活疫苗免疫不同日龄商品肉鸡的效果比较

江兴华1赵华娥1林晓荣1郑敬敏1包松英1林拱阳1王全溪2*
（1.福州大北农生物技术有限公司福州350014；2.福建农林大学动物科学学院福州350002）

使用鸡新城疫-禽流感（H9N2 HP株）二联灭活疫苗分别免疫3、7、14日龄三组商品肉鸡各40羽，同时设一组空白对照组。各免疫组及对照组于3、7、14、21、28、35、42日龄采血检测新城疫、禽流感抗体，于21、28、35日龄进行禽流感病毒攻毒，对比不同日龄免疫组的抗体消涨情况及不同日龄禽流感攻毒结果。发现对照组随鸡日龄增加，新城疫与禽流感抗体逐渐下降，在42日龄时下降至0，而不同免疫组新城疫与禽流感抗体均先下降，21日龄左右开始上升，至35日龄新城疫与禽流感抗体升至6log2以上。3日龄免疫组的禽流感免疫保护效果最好，21、28、35日龄时禽流感强毒攻毒保护率均达100%；7日龄免疫组在21、35日龄时禽流感强毒攻毒保护率均达100%，28日龄时禽流感强毒攻毒保护率达70%；14日龄免疫组在28、35日龄时禽流感强毒攻毒保护率均达100%，21日龄时禽流感强毒攻毒保护率只达30%。试验表明，商品肉鸡选择3日龄免疫鸡新城疫-禽流感（H9N2 HP株）二联灭活疫苗时禽流感免疫保护效果最好，采用3日龄免疫程序可以提高新城疫与禽流感的免疫保护效果，减少养殖业的经济损失。

鸡新城疫、禽流感（H9N2 HP株）二联灭活疫苗肉鸡免疫效果

鸡新城疫（ND）是由新城疫病毒引起的一种烈性病毒性传染病，是当今全球范围内重要的家禽传染病之一。禽流感（Avian Influence，AI）是禽流行性感冒的简称，是由正粘病毒科、流感病毒属A型流感病毒引起的禽类的一种烈性传染病［1］，感染禽类呈亚临诊症状，轻度上呼吸道疾病、产蛋量降低，直至急性全身致死性疾病［2］。在我国，低致病性禽流感以H9N2亚型为主型，流行范围广，占禽流感阳性鸡群总数的93.6%［3］，H9N2亚型禽流感传播能力强，感染发病率高，可造成鸡群产蛋下降及严重影响肉鸡生长速度，与其他病原共同感染导致高死亡率，给养禽业带来巨大的经济损失［4］。对于以上两种病的控制，接种鸡新城疫-禽流感二联灭活疫苗是主要控制方法。据市场上反应，商品肉鸡早期禽流感感染率高，使用新城疫-禽流感二联灭活疫苗后，产生抗体迟缓，抗体水平低，在45日出栏前禽流感保护率低，给养殖户带来巨大的经济损失。针对目前现状，使用福州大北农生物技术有限公司制备的新城疫-禽流感二联灭活疫苗进行试验，通过不同的免疫程序，观察其免疫效果，从而为市场上使用该产品提供最佳免疫程序，以取得最佳效果。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验用疫苗鸡新城疫-禽流感（H9N2 HP株）二联灭活疫苗由福州大北农生物技术有限公司自制，批号：SY2015007。

1.1.2试验用鸡商品肉鸡160羽，由圣农集团孵化厂提供。

1.2试验方法

1.2.1试验分组小鸡出壳后由本公司养至3日龄，选择健康有活力的160羽鸡。随机选40羽编为A组，即3日龄免疫组；随机选40羽编为B组，即7日龄免疫组；随机选40羽编为C组，即14日龄免疫组；随机选40羽编为D组，即空白对照组。并在每羽鸡上打上翅标编号，各组试验鸡分开饲养。

1.2.2免疫方法将A、B、C组商品肉鸡分别于3、7、14日龄免疫本公司自制的鸡新城疫-禽流感（H9N2 HP株）二联灭活疫苗，每羽颈部皮下注射0.2 mL；对照组均不免疫，作为空白对照。

1.2.3抗体监测各免疫组与对照组均随机选择10羽鸡固定采血进行监测抗体，均于3、7、14、21、28、35、42日龄采血检测新城疫与禽流感抗体。

1.2.4抗体检测方法抗体检测用红细胞凝集抑制试验的方法。具体步骤：用PBS将待检血清做2倍系列稀释，加入含4HAU的血凝素抗原液，并设PBS和4HAU血凝素抗原液对照，充分振摇后，置室温下至少20 min或在2～8℃下40～60 min；再加入1%鸡红细胞悬液，置室温20～40 min或置2～8℃40～60 min，当红细胞对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果，以使红细胞凝集被完全抑制的血清最高稀释度作为判定终点。

1.2.5攻毒保护试验方法免疫组与对照组于21、28、35日龄随机选择10羽鸡进行禽流感强毒攻毒，攻毒使用的流感强毒为市场中分离的流行强毒株，将强毒按10倍稀释后，每羽静脉注射0.2 mL，攻毒后5 d，采集鸡泄殖腔棉拭纸，将棉拭纸液体样冻融3次，高速离心15 min（10 000 r/min），每个离心后样品接种10日龄鸡胚5枚，每胚接0.2 mL，培养72 h，收取鸡胚液，测HA效价，HA≥1：16作为攻毒不保护的标准，对病毒感染为阴性的鸡胚，应再肓传一次，再测HA效价。

2　结果

2.1新城疫与禽流感抗体监测结果从新城疫与禽流感抗体监测结果（见表1、图1-图2）可以看出，对照组随鸡日龄增加，新城疫与禽流感抗体逐渐下降，42日龄时下降至0；而不同免疫组新城疫与禽流感抗体均先下降，21日龄左右开始上升，35日龄时新城疫与禽流感抗体升至6log2以上。21日龄时3日龄免疫组新城疫抗体最高，28日龄时三组免疫组新城疫抗体非常接近，35日龄后14日龄免疫组新城疫抗体最高；14、21日龄时3日龄免疫组禽流感抗体最高，28日龄后，免疫日龄大的组禽流感抗体越高。

2.2禽流感攻毒保护试验结果从禽流感攻毒保护结果（见表2、图3）看出，对照组在21、28、35日龄攻毒时，攻毒保护率在20%以下；3日龄免疫组的免疫效果最好，21、28、35日龄的攻毒保护率均是100%；7日龄免疫组在28日龄攻毒时，攻毒保护率只达70%；14日龄免疫组在21日龄攻毒时，攻毒保护率只达30%。

表1　新城疫与禽流感抗体水平监测结果

表2　不同组禽流感攻毒保护试验结果

3　结论与讨论

1）吴庭才等［5］研究表明，商品肉鸡在7日龄后禽流感母源抗体随雏鸡日龄的增加而迅速下降，至28日龄时已趋于消失。攻毒试验中，当禽流感HI效价为6log2左右时，保护率为100%；在4log2时，保护率仅50%；在2log2左右时，保护率只有20%。从本试验中可以看出，雏鸡随日龄增加流感抗体逐渐下降，容易感染禽流感，免疫新城疫-禽流感二联灭活苗后，流感抗体先下降，至21日龄时最低，在3log2以下，只有3日龄免疫组达到3log2，随后抗体开始上升，28日龄均达4log2以上；3日龄免疫组在21日龄时虽然抗体只达3log2，但对攻毒仍可达100%保护，说明使用该产品在抗体不高时仍可达到较好的攻毒保护率。在疫苗的使用过程中，制定合理的免疫程序也是个关健，理论上机体越早免疫就越早产生抗体，越早产生免疫保护力，但也应考虑机体免疫器官未发育完全可能会造成免疫效果不佳的情况。

2）从禽流感抗体监测结果可以看出，3日龄免疫组在14、21日龄时抗体最高，21日龄后各免疫组的抗体越来越接近；在35、42日龄时14日龄免疫组的抗体最高。这一结果表明，早日龄免疫，在早期抗体水平高，到后期时迟免疫组抗体上升快，而且高，可能与免疫日龄大时机体的免疫器官发育更完全有关。

3）从不同组攻毒保护结果看，3日龄免疫组不同时间攻毒的保护结果最好，均达100%，可以说无空档期。虽各时间的抗体不一定最高，但攻毒保护率最高，若要保护40几日龄上市的肉鸡，需尽早免疫新-流二联灭活苗；若要保护40日龄以上的蛋鸡，可选择两周免疫，最终可以产生更高的抗体水平，达到更好的免疫效果。

4）当前，低致病性禽流感毒株在不断发生变化甚至发生变异，部分养殖厂反映禽流感灭活苗不能产生完全免疫保护，但是有研究认为，虽然H9N2亚型禽流感病毒发生了一定变异，但是现有疫苗仍能提供有效保护［6］。万晓朋等［7-8］研究表明，H9N2毒株间有很好的免疫交叉保护性，灭活疫苗免疫鸡不仅能够完全抵抗同源毒株的攻击，对异源毒株的攻击也可产生较好的免疫保护。本试验疫苗使用的禽流感HP株，用HP毒株制备的新城疫-禽流感二联灭活疫苗免疫3日龄商品肉鸡，21、28、35日龄时进行禽流感强毒攻毒，仍有很好的攻毒保护效果；本试验攻毒使用的是市场流行毒株，对于其他毒株攻毒有保护效果。王新卫等［9-12］进行不同毒株攻毒保护试验，虽然攻毒株与疫苗株在抗原性上有差异，但HP株仍能够对毒力、抗原差异的其他禽流感流行毒株的攻毒产生有效保护。

5）在本试验中，免疫鸡新城疫-禽流感（H9N2 HP株）二联灭活疫苗后，商品肉鸡产生抗体均可达到较高的水平。免疫效果不仅要参考抗体水平，更重要的是要看攻毒保护结果，本试验中安排了流感攻毒保护试验，结果攻毒保护率也较高，免疫效果好。本试验是在商品肉鸡上进行的，在蛋鸡上的效果还需通过进一步的试验观察，制定新的免疫程序，以获得满意的免疫效果。

［1］荣骏弓，孙进忠，刘守川，等.鸡新城疫病毒、禽流感病毒二联灭活疫苗免疫试验［J］.中国家禽，2007，29（16）：49-52.

［2］卡尔尼克B W.禽病学［M］.10版.高福，苏敬良，译.北京：中国农业出版社，1999：742-771.

［3］甘孟侯.禽流感［M］.2版.北京：中国农业出版社，2002：1-14.［4］童海兵，张小荣，吴艳涛，等.H9N2亚型禽流感灭活疫苗的免疫效果评价［J］.中国家禽，2010，32（20）：22-25.

［5］吴庭才，张春杰，郭向鹏.禽流感母源抗体消长规律和免疫保护抗体临界值的测定［J］.洛阳农业高等专科学校学报，2002，22（3）：243-244.

［6］荣骏弓，孙进忠，刘守川，等.鸡新城疫病毒（La sota株）、禽流感病毒（H9亚型，HL）二联灭活疫苗免疫试验与禽流感流行株交互免疫研究［C］//中国畜牧兽医学会生物制品学分会中国微生物学会兽医微生物学专业委员会学术研讨会论文集，2007：531-534.

［7］万晓朋，曾显营，田国彬，等.H9N2亚型禽流感流行株灭活疫苗种毒的筛选［J］.中国预防兽医学报，2010，32（4）：276-278.

［8］孙进忠，荣骏弓，刘守川，等.禽流感病毒H9N2亚型HL株与H9亚型流行株抗原相关性及交互免疫的研究［J］.家禽科学，2007（3）：11-13.

［9］王新卫，杨大光，王川庆等.H9N2亚型禽流感病毒不同流行株抗原性和免疫原性的比较研究［J］.畜牧兽医学报，2011，42（11）：1584-1590.

［10］景小冬，章振华，李林，等.H9亚型禽流感病毒流行毒株交叉免疫攻毒保护试验［J］.中国畜牧兽医，2010，37（6）：134-137.

［11］胡江锋，焦铁军，刘淑红，等.鸡新城疫病毒、禽流感病毒二联灭活疫苗与同类产品的免疫效力比较［J］，中国兽药杂志，2011，45（11）：9-11.

［12］陈圆，古涛，韩敏，徐大伟，等.H9N2亚型禽流感灭活疫苗最小免疫剂量及抗体消长规律的初步研究［J］.中国动物传染病学报，2013，21（1）：12-16.

Comparision of immune effects of bivalent inactivated vaccines containing newcastle disease virus and avian influenza virus in different days of commercial broiler chickens

Jiang Xinghua1Zhao Huae1Lin Xiaorong1Zheng Jingmin1Bao Songying1Lin Gongyang1Wang Quanxi2*
（1.Fuzhou Dabeinong Biotech Co.Ltd.，Fuzhou 350014；2.College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002）

3，7，14-day-old forty commercial broiler chickens were respectively inoculated with bivalent vaccines containing inactivated Newcastle disease virus（NDV）and avian influenza virus（AIV）and simultaneously，chickens were mock inoculated as control group.In order to detection antibodies against NDV and AIV，blood samples were collected from 3，7，14，21，28，35 and 42-day-old chickens in both immune groups and control groups，and 21，28 and 35-day-old chickens were infected with AIV，respectively.Antibody levels against NDV and AIV，as well as mortality of each group were detected for comparative analysis.The results showed that antibodies against NDV and AIV in control group represented an gradual decline as days went，till to zero on 42th day，antibody levels of immune groups decreased in the early stage，and began to increase since 21th day，ending up with 6log2 on 35th day.Immune protection effect of 3-old-day immune group was the best and protection rate against AIV reached 100 percent on 21，28 and 35-day-old chickens. Protection rate of 7-old-day immune group was 70%on 28-day-old and that of 14-old-day immune group was 30%on 21-day-old. In conclusion，better immune protection against AIV was obtained from commercial broiler chickens inoculated with bivalent vaccine containing inactivated NDV and AIV on 3-day-old，which could improve immune protection effect against NDV and AIV and reduce economic losses of poultry industry.

Bivalent vaccine containing inactivated NDV and AIV（H9N2 HP strain）Broiler chickens Immune effects

A

1003-4331（2016）05-0018-04

福州市区域重大项目（2015-Q-29）资助。

江兴华（1975-），男，高级兽医师，硕士生校外导师。主要从事兽用疫苗的生产与研发，jxhgreen@163.com。

王全溪（1978-），男，副教授，博士研究生，硕士生导师。研究方向为宿主与病原互作，wqx608@126.com。