消落带土壤黑碳降解过程中真菌群落结构及酶活特征

郝蓉，康杰，伍玉鹏，胡荣桂，宋艳暾

消落带土壤黑碳降解过程中真菌群落结构及酶活特征

郝蓉，康杰，伍玉鹏，胡荣桂，宋艳暾*

华中农业大学资源与环境学院//农业部长江中下游耕地保育重点实验室，湖北 武汉 430070

黑碳是生物质或化石燃料不完全燃烧或岩石风化形成的一种富含芳香族基团的产物，普遍存在于环境中，在全球碳循环中占有重要的位置。早期黑碳被认为是不可降解的，近年来许多证据表明黑碳是可降解的。腐生真菌降解是其降解的重要途径，该过程需要木质素降解酶的参与。然而，目前对降解黑碳的真菌群落结构和酶的种类和活性认识十分有限。选取消落带的典型土壤为研究对象，采用18S rDNA基因测序法，解析了消落带土壤黑碳降解过程中真菌群落结构，测定了木质素降解酶活性。结果表明，（1）该区土壤真菌以子囊菌（Ascomycota）和担子菌（Basidiomycota）为主。其中子囊菌以粪壳菌纲（Sordariomycetes）为优势类群，其次为散囊菌纲（Eurotiomycetes）、座囊菌纲（Dothideomycetes）；担子菌以伞菌纲（Agaricomycetes）为优势类群。（2）木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）和漆酶（Lac）在该区土壤中均有不同程度检出，与LiP和Lac相比，M nP活性相对较低。同时明确了研究消落带土壤黑碳降解应从水分对降解过程的影响和机制入手，并重视环境效应。该研究可为深入研究黑碳的生物地球化学循环提供重要依据。

土壤真菌；木质素降解酶；黑碳；18S rDNA；消落带

引用格式：郝蓉， 康杰， 伍玉鹏， 胡荣桂， 宋艳暾. 消落带土壤黑碳降解过程中真菌群落结构及酶活特征［J］. 生态环境学报，2016， 25（7）： 1140-1145.

HAO Rong， KANG Jie， WU Yupeng， HU Ronggui， SONG Yantun. Fungal Community Structure and Ligninolytic Enzyme Activities during Decomposition of Soil Black Carbon in A Water-level-fluctuating Zone ［J］. Ecology and Environmental Sciences， 2016，25（7）： 1140-1145.

黑碳是生物质或化石燃料不完全燃烧或岩石风化形成的一种富含芳香族基团的产物，普遍存在于环境中。黑碳产生后，土壤是其最初的沉积地，由于具有很强的生物和化学惰性，黑碳可长期存在于土壤中，成为惰性碳库的重要组成部分，在土壤碳循环中占据重要地位（Kuhlbusch，1998）。

早期黑碳被认为是几乎不可降解的。近年来，许多证据表明黑碳是可降解的（Hockaday，2006；Cheng et al.，2008）。Hockaday et al.（2006）运用超高分辨率电喷雾电离质谱对森林土壤黑碳的降解进行研究，提出腐生真菌降解是其降解的重要途径，这为土壤黑碳的降解提供了直接分子证据。但目前对降解黑碳的真菌群落结构认识十分有限（Hamer et al.，2004）823-830。微生物产生的酶可参与土壤中多种反应过程（如矿化-同化、氧化-还原等），在有机质降解中同样起关键作用（Ahn et al.，2009）。研究已明确土壤黑碳降解需要木质素降解酶的参与（Hockaday，2006；Wengel et al.，2006），而这些酶的种类和活性将影响降解过程和降解速率（Tuomela et al.，2002；Berg et al.，2007），但目前并不清楚黑碳降解中这些酶的种类和活性（Hamer et al.，2004）823-830。

国内外已有大量有关大气溶胶、海洋沉积物和雪冰中的黑碳的报道，但对土壤黑碳研究较少。我国土壤黑碳研究尚处起步阶段。消落带作为一种特殊湿地，不仅在土壤有机质的源汇方面发挥着重要作用，而且在污染物的拦截以及改善水体质量方面也有重要作用（Anbumozhi et al.，2005）。消落带内强烈的水文效应和人为活动可影响土壤微生物和酶活状况（马朋等，2014），而涉及土壤黑碳降解过程中真菌与木质素降解酶的研究还未见报道。本研究选取丹江口库区消落带土壤为研究对象，从分子水平上分析该区土壤真菌群落结构，测定主要木质素降解酶的活性，探讨土壤黑碳降解在消落带的环境效应，以期为深入研究土壤黑碳的降解机制及过程和评价水体环境质量提供理论依据和科学参考。

1　研究区概况与研究方法

1.1研究区概况

丹江口水库（32°36′～33°48′N，110°59′～111°49′E）位于南水北调中线工程的水源区，属我国亚热带季风气候。年平均气温15～16 ℃，无霜期230～250 d，年均降水量800～1000 mm。土壤以黄棕壤为主。地带性森林植被为亚热带常绿阔叶林。消落带原生植被破坏殆尽，现有植被以少量灌丛和草被为主。一期工程建成后，至今已蓄水50余年，形成148 km2消落带。二期大坝加高工程完成后，将较大程度上缓解中线工程沿线河南、河北、天津、北京等省市的用水困境。

1.2研究方法

1.2.1采样方法与样品处理

2014年12月，根据研究目的和地形特征，在库区两岸149～157 m之间的消落带进行采样。在采样区域内，用蛇形布点法取混合样，取表层土，充分混匀后分成2份。1份放入低温冷冻冰袋中，实验室-40 ℃保存，用于18S rDNA分析。另1份自然风干，研磨过筛，用于土壤理化性质分析（见表1）。

1.2.218S rDNA的PCR扩增、测序及分析

真菌DNA的提取用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒。纯化后的总DNA进行PCR扩增、测序。PCR扩增引物为EF4：GGAAGGGRTGTATTTA TTAG；NS2：GGAAGGGRTGTATTTATTAG。PCR反应条件为95 ℃变性3 m in，然后95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环后，于72 ℃延伸5 min。将测得的18S rDNA序列运用GenBank中的BLAST工具软件在DNA库进行搜索和比较分析，根据BLAST搜索和比较的结果，运用MEGA 4.0软件构建系统发育树。

1.2.3酶活测定

本研究中测定的木质素降解酶种类有：木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）、漆酶（Lac）。分别取一定量样品，加入各种酶的提取缓冲溶液（LiP用酒石酸缓冲溶液，250 mmol·L-1，pH 3.0；MnP用酒石酸缓冲溶液，50 mmol·L，pH 4.5；Lac用酒石酸钠缓冲溶液，50 mmol·L-1，pH 4.5），振荡浸提，离心后取上清液过滤，滤液测定酶活。

LiP测定用藜芦醇法（Tien et al.，1988），一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化藜芦醇产生1 μmol藜芦醛所需酶量；M nP测定方法见文献（Hiroyuki et al.，1992），一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化Mn2+产生1 μmol Mn3+所需酶量；Lac测定采用ABTS法（Childs et al.，1975），一个酶活单位（U）定义为每分钟氧化1 μmol ABTS所需酶量。一个酶活单位用U·g-1来表示（Fujii et al.，2013）。

表1　样点的土壤理化性质Table 1　Soil physio-chemical properties in the samples

2　结果与讨论

2.1土壤真菌的群落结构

由图1可知，该区土壤真菌以子囊菌（Ascomycota）和担子菌（Basidiomycota）为主。其中子囊菌以粪壳菌纲（Sordariomycetes）为优势类群，其次为散囊菌纲（Eurotiomycetes）、座囊菌纲（Dothideomycetes）；担子菌以伞菌纲（Agaricomycetes）为优势类群。

研究表明，青霉属（Penicillium）、木霉属（Trichoderma）和曲霉属（Aspergillus）在我国不同类型土壤中，出现几率相对较高，其分布不受地区、土类和植被限制（刘淑霞等，2008；林璐等，2012），但本研究中并未以这些种属为明显优势群落，而与黄渤海沉积物的真菌群落结构的结果更相似。程晓丽（2014）研究了黄渤海沉积物中真菌多样性，结果表明其以子囊菌门粪壳菌纲和座囊菌纲、担子菌门伞菌纲为优势类群。本研究区消落带土壤经历了50多年的周期淹水，每年淹水时间长达6个月。虽然消落带土壤受植被生长的影响，而植物群落类型可初步决定微生物群落的组成（张薇等，2005），但消落带植被多为1年生草本植物，生长期相对短，再加上长期淹水，使消落带土壤一定程度上更接近沉积环境。即在局部生态条件相似的不同地区，土壤真菌种类和组成可能极为相似。

图1　土壤真菌的18s rRNA 基因系统发育树Fig. 1　Phylogenetic trees based on 18S rDNA sequences in soil of study　area

目前普遍接受的观点认为菌比子囊菌具有更强的分辨能力（Osono er al,2002,2006;Osono et al,2007）对子囊菌的降解酶系统了解较少（Oson et al, 2007）,当然一下子囊菌也可产生木质素降解酶（Baldrian，2006）。在本研究区域中子昂菌占优势类群以壳菌港粪、散囊菌港、做囊菌们比担子菌门居右更快的进化速度；在子囊菌内部，粪壳钢较化更快的进化速率、散囊纲具有更快的进化速度、散囊纲居右第二快得进化速度、座囊菌港具有第三块的进化速度。据此，开展子囊菌及其没系统的研究十分必要。

2.2土壤中木质素降解酶活性分析

一般认为木质素过氧化物酶（Lip）、过氧化物物酶（Map）、漆美（Lac）是构成木质素降解酶的主要成分（Tien er al. 1983;Kirk er al,1987;Leonowics eral,2001）。由表2克制，Lip/Mnp 和Lac在该区土壤均有不同程度的检出，不同种类酶的活性存在很大变异性，Mnp活性比Lip和Lac的底。

表2　研究区域土壤木质素降解酶的活性Table 2　Ligninolytic enzyme aactivities of soil instudy area

Criquet et al.(2000)的研究表明Lip主要来自于木材类物质，土壤中几乎不能检测到。但本研究Lip酶过达到了11.0*10.这与该区土壤真菌以担子菌为优势种群有关，只有担子菌可以产生Lip、Mnp（Morgensten er al,2008）.有研究表明Mnp仅在酸性条件下才能检出（Criquet er al,200;Fujj er al 2013）但本研究，Mnp在土壤中性条件下页表现出一定活性，这与Vares er al(1997及Steffen （2003）的研究相似。起原因除了与担子具能够适应宽泛的pH值有关，还与担子菌种类多有关，同时也与担子菌能产生多种多样的MNP有关。活性在本研究这种相对较高，壳做如下解释，（1）该区土壤较多的可利用基质，例如酚醛树脂。研究区域消落带土壤植被多为一年生草本植物，这些草本植物的凋落物在分解早期会释放大量的酚醛树脂（Kuiters et al.，1986）。（2）本研究测定Lac活性所用的方法是2， 2′-连氮-3-乙苯-二噻唑-6-磺酸（ABTS）法，相比Criquet et al.（2000）和Fujii et al.（2013）用的丁香醛连氮法，其测值偏高，有学者评价ABTS法更能准确反映Lac活性（Snajdr et al.，2008）。

尽管酶的种类和活性很大程度取决于真菌种类，LiP和MnP都来自担子菌（M orgenstern et al.，2008），但本研究中LiP和MnP并未表现出一定相关性（r=-0.047）。这除了与MnP由广泛的担子菌产生，而LiP仅由专门的担子菌（如多孔菌目）产生有关（M orgenstern et al.，2008）外，还与该区土壤化学性质有很大关系（Tuomela et al.，2002；Osono et al.，2007），值得进一步研究（Hamer et al.，2004）823-830。

LiP、M nP和Lac作为高效催化剂参与木质素降解，其机理主要是在分子氧参与下，依靠自身形成的H2O2，触发启动一系列自由基链反应，实现彻底氧化。尽管黑碳的结构与木质素组分结构相似（Hamer et al.，2004），但在成分和结构上有其独特性，这就使其与微生物的相互作用机理不仅有普适性，也有特殊性，揭示其降解过程与机理将是未来黑碳研究的重要内容（Hamer et al.，2004823-830；Hockaday et al.，2006）。

2.3土壤黑碳降解在消落带的环境效应

由于黑碳的降解速度慢，被认为代表了大气圈-生物圈快速碳循环中的一个汇，也是长期地质碳循环中的一个源。水分作为消落带生态系统健康和完整的主要影响因素，在黑碳分解中起重要作用（Nguyen et al.，2009）。消落带的周期裸露和浸泡使其土壤的干湿交替状态有别于陆生和水生环境，故黑碳降解也不同于陆地和水生生态，但目前涉及消落带土壤黑碳稳定的一些关键过程尚不清楚，例如水分对真菌参与降解的影响过程、机理及其与其它环境条件耦合所产生的影响等，这些都将影响全球碳循环的途径和速率，亟待研究。此外，有研究发现木质素在寒冷、干燥的条件下比在炎热、潮湿的条件下分解更快（Donnelly et al.，1990；Berg et al.，1997；Osono et al.，2006），然而这个说法仍有待验证。由此，揭示不同气候条件下土壤黑碳的分解规律特征，将有可能重塑人们对不同区域土壤的源/汇功能的认识。

黑碳降解后其性质结构将发生变化，如基本元素组成（Cheng et al.，2008；Hockaday et al.，2006）、疏水性（Ahmad et al.，2014）和吸附性（Cheng et al.， 2009）等。进一步研究发现黑碳降解后的水溶性产物多为浓密的芳环结构，且与DOM有相似的化学结构（Hockaday et al.，2006）。丹江口库区作为南水北调中线工程的水源区，二期工程运行后每年调水9.50×109m3，好的水质将决定工程的成败。土壤黑碳降解产物将成为DOM的重要组成部分（Hockaday et al.，2006），而DOM对污染物的毒性及其迁移特性甚至水质等都有直接影响（吴鑫等，2003）。前期研究表明消落带土壤黑碳在污染物的归趋方面可发挥重要作用（Hao et al.，2014），因此开展黑碳降解及其环境效应研究可为评价水体环境质量提供科学依据。

3　结论

（1）研究区土壤真菌以子囊菌（Ascomycota）和担子菌（Basidiomycota）为主。其中子囊菌以粪壳菌纲（Sordariomycetes）为优势类群，其次为散囊菌纲（Eurotiomycetes）、座囊菌纲（Dothideomycetes）；担子菌以伞菌纲（Agaricomycetes）为优势类群。

（2）LiP、MnP和Lac在该区土壤中均有不同程度的检出，与LiP和Lac相比，MnP活性相对要低。

（3）消落带土壤黑碳研究应着重探讨水分对真菌降解的影响过程、机理及其与其它环境条件耦合所产生的影响，同时重视降解后的环境效应。

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Fungal Community Structure and Ligninolytic Enzym e Activities during Decom position of Soil Black Carbon in A W ater-level-fluctuating Zone

HAO Rong， KANG Jie， WU Yupeng， HU Ronggui， SONG Yantun*
Key Laboratory of Arable Land Conservation （M iddle and Lower Reaches of Yangtze River）， M inistry of Agriculture//College of Resources and Environment，Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China

Black carbon （BC） is a general term used to describe products derived from incomplete combustion of vegetation and fossil fuels. BC may play an important role in the global C budget. Despite the relative recalcitrance of BC， recent laboratory and field studies indicated that BC can be degraded. Saprophytic fungi and ligninolytic enzyme may be im portant to soil BC degradation processes. Based on sequencing of the fungal 18S rDNA fragments and the measurements of soil enzyme activities， the main fungal populations and ligninolytic enzyme activities in the water-level-fluctuating zone of Danjiangkou were investigated. The results showed that the majority of the recovered sequences in the area belonged to diverse phylotypes of Ascomycota and Basidiomycota. Sordariomycetes， Eurotiom ycetes and Dothideom ycetes among Ascomycota w as dom inant， Agaricomycetes among Basidiomycota was dominant. Main ligninolytic enzyme had been detected in our study area. MnP activities are lower compared to LiP and Lac activities. The authors also propose the effects of water regimes on black carbon degradation process and mechanism require further investigations， further environmental effects could not be ignored. The study may be useful for BC biogeochem ical cycles and will hopefully elicit more research in this field.

soil fungal； ligninolytic enzyme； black carbon； 18S rDNA； water-level-fluctuating zone

10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.07.007

X172； S154

A

1674-5906（2016）07-1140-06

国家自然科学基金项目（41101522；41471432）

郝蓉（1976年生），女，副教授，博士，从事污染与恢复生态学研究。E-mail： haorong@mail.hzau.edu.cn *通信作者，E-mail： songyt@mail.hzau.edu.cn

2016-01-13