响应面法优化酶法提取马鲛鱼油

黄惠莉, 童记强, 汪泳, 马赫

(1. 华侨大学 化工学院， 福建 厦门 361021;2. 惠安瑞芳食品有限公司, 福建 泉州 362131)



响应面法优化酶法提取马鲛鱼油

黄惠莉1, 童记强1, 汪泳2, 马赫1

(1. 华侨大学 化工学院， 福建 厦门 361021;2. 惠安瑞芳食品有限公司, 福建 泉州 362131)

为了提高马鲛鱼的综合利用价值，采用单因素实验和响应面优化实验对马鲛鱼下脚料中鱼油的提取工艺进行研究，并对其脂肪酸组成进行分析.结果表明：马鲛鱼油提取的适宜工艺条件是pH值为7，中性蛋白酶加酶量为1.5%，酶解时间为3 h，液固比为3∶1，酶解温度为52 ℃，马鲛鱼油提取率为75.38%.对马鲛鱼油的脂肪酸进行分析，共检出12种脂肪酸，其中，不饱和脂肪酸质量分数为54.13%，二十碳五烯酸(EPA)质量分数为8.40%，二十二碳六烯酸(DHA)质量分数为7.06%，EPA和DHA的质量分数较高.

马鲛鱼油； 酶解; 脂肪酸; 响应面法

马鲛鱼(Scomberomorusniphonius)体内含有较多的脂肪酸，尤其是不饱和脂肪酸和蛋白.常食可增强机体免疫力[1].目前，马鲛鱼的利用主要在冻品、鲜销,以及制备马鲛鱼卷或其他鱼食品方面[2].在马鲛鱼制品的加工过程中，下脚料废弃较多，充分开发这些下脚料有利于提高马鲛鱼的附加值.近年来，关于鱼类油脂提取工艺的研究较多[3-6]，但利用马鲛鱼下脚料提取鱼油的研究较少[7].目前，鱼油的提取方法主要有压榨法、溶剂法、蒸煮法、淡碱水解法、酶解法与超临界流体萃取法等[5,8-9].酶解法是利用蛋白酶对蛋白质的水解，破坏蛋白质和鱼油的结合关系，从而释放出鱼油.酶解法提取鱼油工艺条件温和，提取出的鱼油品质好，且蛋白质水解液可以再利用.本文通过酶法水解马鲛鱼下脚料，通过响应面法优化酶法水解工艺，并测定其脂肪酸组成.

1　材料与方法

1.1主要试剂和仪器

1.1.1实验原料将马鲛鱼下脚料(主要为鱼皮和鱼骨，福建省泉州市惠安瑞芳食品有限公司)于-20 ℃的冰箱冷冻，再将其切碎，贮藏备用.

1.1.2实验药品木瓜蛋白酶(酶活333.4 kat·g-1)、风味蛋白酶(酶活6.668 kat·g-1)、中性蛋白酶(酶活66.68 kat·g-1)、碱性蛋白酶(酶活6.668 kat·g-1)、动物蛋白酶(酶活0.25 kat·g-1)均由南宁庞博生物工程有限公司提供；石油醚(沸点60～90 ℃)、盐酸、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇、硫酸、正己烷(分析纯)均由上海国药集团化学试剂有限公司提供.

1.1.3实验仪器与设备SXT-02型索氏提取器(上海洪纪仪器设备有限公司)；ME204E型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；PK-S22型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；HJ-4A型数显恒温磁力搅拌器(江苏省金坛市医疗仪器厂)；pH 700型台式pH计(美国优特公司)；TG16-WS型台式高速冷冻离心机(长沙市湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；GCMC-QP 2010 Plus型气相质谱联用仪(日本岛津公司).

1.2实验方法

1.2.1马鲛鱼下脚料基本成分的测定水分测定采用常压干燥法，参照国家标准GB 5009.3-2010《食品中水分的测定》；粗蛋白质测定采用凯氏定氮法，参照国家标准GB 5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》；粗脂肪测定采用索氏提取法，参照国家标准GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的测定》；灰分测定可采用灼烧法，参照国家标准GB 5009.4-2010《食品中灰分的测定》.

1.2.2酶法提取马鲛鱼油工艺称取25 g 马鲛鱼下脚料，放入250 mL烧杯中，加一定量的水，调节pH值，加入一定量的蛋白酶，控制搅拌速度为400 r·min-1，在一定温度条件下，酶解一定时间.酶解完成后，在8 000 r·min-1的条件下，离心10 min，分离出上层液，即为马鲛鱼油.最后称量，计算提取率，提取率的计算式为

式中：w为马鲛鱼下脚料的粗脂肪质量分数.

1.2.3单因素实验根据实验结果，选择蛋白酶种类、pH值、温度、液固比、加酶量、酶解时间作为单因素，以鱼油提取率为评价参数，确定酶法提取马鲛鱼油的工艺范围.

1.2.4响应面优化实验根据单因素实验的结果，选取加酶量(ψ)、酶解时间(t)、液固比、酶解温度(θ)等4个影响因素为自变量，以鱼油提取率作为响应值，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，运用Design Expert 8.0进行响应面设计.+1，0，-1分别代表4因素的高、中、低水平，设计响应面实验因素水平，如表1所示.

表1　响应面实验因素水平表

1.2.5气质联用测脂肪酸组成[10]取2滴样品于10 mL试管，加0.5 mol·L-1氢氧化钾-甲醇溶液1.0 mL，摇匀，在60 ℃水浴中反应30 min.取出冷却至室温，加入3 mL质量分数为14%的硫酸-甲醇溶液，摇匀，60 ℃水浴加热5 min，冷却至室温，加入3 mL正己烷提取上层溶液用于气相色谱分析.

色谱柱为Rtx-5Ms，载气为高纯氦，进样温度为260 ℃，柱流量为2.05 mL·min-1，分流比为30∶1.程序升温条件为120 ℃，保持1 min，以10 ℃·min-1升温到200 ℃，保持5 min，再以10 ℃·min-1升温到240 ℃，保持5 min.电离方式为电子轰击电离(EI)，离子源温度为230 ℃，接口温度为250 ℃，质荷比为45.00～400.00 m·z-1，检测器电压为1 kV.

2　结果与讨论

2.1马鲛鱼下脚料基本成分

经检测，马鲛鱼下脚料中粗蛋白质量分数为22.76%，粗脂肪质量分数为7.22%，可作为提取油脂的良好原料.

图1　不同蛋白酶对马鲛鱼油提取率的影响Fig.1　Effect of different kinds of protease on extraction rate of spanish mackerel oil

2.2单因素实验

2.2.1不同蛋白酶对马鲛鱼油提取率的影响在加酶量为马鲛鱼下脚料质量的0.2%，酶解时间为3 h， 液固比为1∶1，以及酶最适pH值和温度的条件下进行酶解.不同蛋白酶对马鲛鱼油提取率(δ)的影响，如图1所示.

由图1可知：木瓜蛋白酶得到的鱼油提取率最高，约73%；其次为碱性蛋白酶和中性蛋白酶.虽然木瓜蛋白酶的提取率最高，但木瓜蛋白酶的价格是中性蛋白酶价格的两倍，因此，对工业生产而言不是很经济.而中性蛋白酶是在pH值为7的条件下，在水体系下的pH值约为7，无需加其他物质调节pH值，这适用于于工业生产.因此，实验采用中性蛋白酶提取马鲛鱼油.

2.2.2pH值对马鲛鱼油提取率的影响在酶解温度为50 ℃，液固比为1∶1，加酶量为马鲛鱼下脚料质量的0.2%，酶解时间为1 h，pH值分别为5,6,7,8,9的条件下进行实验，考察pH值对鱼油提取率的影响，结果如图2所示.

由图2可知：随着pH值的升高，鱼油提取率上升；当pH值超过8，鱼油提取率下降.这是因为酶在特定条件下都有最适pH值，pH值过高或过低都会导致酶的活性降低，甚至失活[11].由于pH值在6～8时鱼油提取率变化不大，因此，在条件优化时，忽略pH值这个单因素.

2.2.3酶解温度对马鲛鱼油提取率的影响在pH值为7,液固比为1∶1,加酶量为马鲛鱼下脚料质量的0.2%,酶解时间为1 h，酶解温度分别为20，30，40，50，60 ℃的条件下进行实验，考察酶解温度对鱼油提取率的影响，结果如图3所示.

由图3可知：随着酶解温度的升高，鱼油提取率逐渐升高；当酶解温度为50 ℃时，提取率最高；当酶解温度超过50 ℃时，提取率反而下降.这是因为温度的升高有助于提高分子热运动，使酶能更好地与底物结合[12].温度过高，鱼油的颜色也会加深，影响鱼油品质.因此，最适酶解温度选择50 ℃.

图2　pH值对马鲛鱼油提取率的影响 图3　酶解温度对马鲛鱼油提取率的影响　　　　Fig.2　Effect of pH on extraction Fig.3　Effect of hydrolysis temperature on 　　　　　rate of spanish mackerel oil extraction rate of spanish mackerel oil

2.2.4液固比对马鲛鱼油提取率的影响在pH值为7，酶解温度为50 ℃，加酶量为马鲛鱼下脚料质量的0.2%，酶解时间为1 h，液固比分别为1∶2，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1的条件下进行实验，考察液固比对鱼油提取率的影响，结果如图4所示.

由图4可知：随着液固比的增加，鱼油提取率逐渐上升；当液固比上升到2∶1时，提取率最高；当液固比继续升高，鱼油提取率反而下降.在反应体系中，当水的质量分数较低时，酶在反应体系中分布不均，不能很好地与底物接触[13];当水的质量分数过高时，酶的相对浓度降低，使酶和底物接触减少，鱼油提取率会下降.因此，最适的液固比选择2∶1.

2.2.5加酶量对马鲛鱼油提取率的影响在pH值为7，酶解温度为50 ℃，液固比为2∶1，酶解时间为1 h，加酶量为马鲛鱼下脚料质量的0%，0.2%，0.5%，1%，3%的条件下进行实验，考察加酶量对鱼油提取率的影响，结果如图5所示.

图4　液固比对马鲛鱼油提取率的影响 图5　加酶量对马鲛鱼油提取率的影响　　Fig.4　Effect of liquid to solid ratio on 　 Fig.5　Effect of enzyme dosage on extraction　vextraction rate of spanish mackerel oil 　rate of spanish mackerel oil

由图5可知：随着加酶量的增加，鱼油提取率也升高；当加酶量达到1%后，继续增加酶的质量分数，鱼油提取率没有明显变化，有少量下降.随着酶质量分数的增加，更多的蛋白质被降解，被释放的脂肪质量分数也随之增加[14].但当反应达到饱和后，过量的酶会对酶自身产生水解作用，导致提取率有少量降低.因此，最适的加酶量为下脚料质量的1%.

图6　酶解时间对马鲛鱼油提取率的影响Fig.6　Effect of hydrolysis time on extraction rate of spanish mackerel oil

2.2.6酶解时间对马鲛鱼油提取率的影响在pH值为7，酶解温度为50 ℃，液固比为2∶1，加酶量为马鲛鱼下脚料质量的1%的条件下，调节酶解时间分别为0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h进行实验，考察酶解时间对鱼油提取率的影响，结果如图6所示.

由图6可知：随着酶解时间的增加，鱼油的提取率逐渐升高；当酶解时间达2 h时，鱼油提取率达71.2%；继续增加酶解时间，鱼油提取率没有明显变化；随着酶解时间的增加，酶和底物能更加充分地作用.因此，鱼油提取率上升.但酶解时间越长，提取鱼油的工艺生产周期也越长，不利于工艺生产的经济效益.因此，最适的酶解时间选择为2 h.

2.3响应面法优化酶解条件

响应面实验结果，如表2所示.表2中：δ为提取率.对表2的数据进行多项式拟合回归，经优化后得到以鱼油得率(Y) 为因变量，以加酶量(A)、酶解时间(B)、液固比(C)、酶解温度(D)为自变量的回归方程，即

Y=64.37+4.81A+1.28B+4.14C+2.16D+8.45AB+

5.28AC+2.99AD+1.92BC+0.92BD+2.80CD-

7.60A2-3.56B2-3.43C2-11.31D2.

因此，此模型建立成功，适合用于酶法提取马鲛鱼油的条件优化.其中，A，C，D，AB，AC，A2，B2，C2，D2的P值均小于0.05，对鱼油提取率影响具有统计学意义，根据模型的线性数值大小，可以得出各因素对鱼油提取率的影响大小为A>C>D>B，即加酶量>液固比>酶解温度>反应时间.加酶量和酶解时间、加酶量和液固比的交互作用对鱼油提取率的影响较大.

表2　响应面实验结果

表3　回归方程方差分析表

2.4最佳条件预测与验证

根据Box-Behnken方法分析，得到鱼油提取率的最佳反应条件：加酶量为1.5%,酶解时间为3 h,液固比为3∶1,酶解温度为51.98 ℃.此时,提取率的预测值为77.41%.将其最佳反应条件进行调整：加酶量为1.5%，酶解时间为3 h，液固比为3∶1，酶解温度为52 ℃，在此条件下进行3次平行实验，得平均值为75.38%，与理论值接近.这说明采用响应面优化得到的DAG数据可靠，具有预测使用价值.

2.5马鲛鱼油脂肪酸组成分析

对提取的马鲛鱼油进行GC/MS分析，结果如表4所示.表4中：η为质量分数.由表4可知：从马鲛鱼油分离出12种脂肪酸，多不饱和脂肪酸以二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)为主.由此可知：马鲛鱼油中EPA和DHA的质量分数比一般鱼类的高[11,13-14]，具有一定的开发利用价值.

表4　马鲛鱼油脂肪酸组成

3　结论

1) 通过马鲛鱼下脚料提取单因素设计和响应面优化,得到马鲛鱼油提取的预测模型.最佳提取条件：pH值为7，中性蛋白酶加酶量为马鲛鱼下脚料质量的1.5%，酶解时间为3 h，液固比为3∶1，酶解温度为52 ℃，马鲛鱼油提取率为75.38%.

2) 采用GC/MS对马鲛鱼油进行分析，检测出12种脂肪酸.其中，棕榈酸的质量分数最高，达到22.98%；不饱和脂肪酸质量分数为54.13%，油酸质量分数最高.多不饱和脂肪酸以EPA，DHA为主，EPA的质量分数为8.40%，DHA质量分数为7.06%，马鲛鱼油的EPA和DHA的质量分数比一般粗鱼油更高.

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(责任编辑： 钱筠英文审校： 刘源岗)

Optimization of Enzymatic Extraction Conditions of Spanish Mackerel Oil by Response Surface Methodology

HUANG Huili1, TONG Jiqiang1, WANG Yong2, MA He1

(1. College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361021, China;2. Huian Ruifang Food Corporation Limited, Quanzhou 362131, China)

In order to improve the comprehensive utilization value of spanish mackerel (Scomberomorusniphonius), the single factor and response surface optimization experiments were used to study the extraction process of oil from spanish mackerel waste and the fatty acid composition was also analyzed. Experiment results showed that: pH 7.5, dosage of neutral protease enzyme 1.5%, hydrolysis time 3 h, rate of liquid to material 3∶1, and hydrolysis temperature 52 ℃ were the optimal processing conditions. Under these conditions, the extraction rate of spanish mackerel oil was 75.38%. Furthermore, by fatty acid analysis of spanish mackerel oil, 12 kinds of fatty acids were determined. The unsaturated fatty acids were 54.13% of the total fatty acids, and EPA was 8.40%, DHA was 7.06%, which showed higher content of EPA and DHA.

spanish mackerel oil； enzymatic hydrolysis; fatty acid; response surface methodology

10.11830/ISSN.1000-5013.201605014

2015-09-28

黄惠莉(1962-)，女，教授，主要从事海洋水产资源开发利用的研究.E-mail:hlhuang@hqu.edu.cn.

福建省重点科研资助项目(2013N0022)

TS 224； TQ 644

A

1000-5013(2016)05-0595-05