全血γ干扰素释放试验诊断结核病的临床应用价值

孔海芳，岳娜，刘刚，李妍淳，田彬，胡志东△

全血γ干扰素释放试验诊断结核病的临床应用价值

孔海芳1，岳娜1，刘刚2，李妍淳1，田彬1，胡志东1△

目的评价全血γ干扰素（IFN-γ）释放试验（QFT-GIT）诊断结核病的临床应用价值。方法收集天津医科大学总医院2014年10月—2015年10月109例（确诊病例45例，临床诊断病例64例）结核病患者（结核组）和70例非结核呼吸系统疾病患者（非结核组）资料，同时采用QFT-GIT、胶体金抗结核抗体（TB-Ab）进行检测，绘制IFN-γ释放量受试者工作者特征（ROC）曲线，比较2种方法的诊断价值及QFT-GIT试验在2组中的差异。结果QFT-GIT对结核病的诊断敏感度为93.58%，特异度为85.71%，其诊断阳性率高于TB-Ab（χ2=43.68，P＜0.01）。2种方法联合检测的敏感度降至52.29%（57/109），但特异度增加至90.00%（63/70）。结核组IFN-γ释放量明显高于非结核组（U=330，P＜0.05），IFN-γ释放量ROC曲线下面积为0.913（95%CI：0.864～0.963）。结论QFT-GIT试验在结核病诊断中具有较高的敏感度和特异度，与TB-Ab联合检测可进一步提高诊断的特异度，为临床结核病的诊断提供及时有效的依据。

结核；卡介苗；诊断试验，常规；敏感性与特异性；ROC曲线；γ干扰素释放试验；结核抗体

结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌感染引起的严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病，其造成的死亡人数仅次于艾滋病，被列为我国重要传染病之一［1］。2013年全球估计有900万结核病的新发病例，有150万患者死于结核病［2］。据世界卫生组织（WHO）统计，目前我国结核病年发病人数为130万，占全球发病人数的14%，成为全球结核病第二大国［3］。2010年全国结核病流行病学调查显示，活动性肺结核患病率为0.5%，约有600万活动性肺结核患者［4］。迄今为止，临床上用于结核分枝杆菌感染的诊断方法仍存在很多不足，结核分枝杆菌培养时间长，核酸检测技术要求高，结核菌素试验（Tuberculin skin testing，TST）易受卡介苗（BCG）的干扰。因此，开发新的快速诊断技术迫在眉睫。

全血可溶性γ干扰素（IFN-γ）释放试验（QuantiFERON TB Gold In-Tube，QFT-GIT）具有操作简便、检测自动化等优点。本文通过比较QFTGIT试验在结核与非结核患者中结果的差异，探讨QFT-GIT试验在结核病诊断中的临床应用价值。

1　对象与方法

1.1研究对象收集天津医科大学总医院2014年10月—2015年10月住院患者中筛查出的109例结核患者（确诊病例45例，临床诊断病例64例）作为结核组，男53例，女56例，年龄11～99岁，中位年龄60（45，71）岁。参照《肺结核诊断标准（WS288—2008）》，结核分类标准参照《临床诊疗指南（结核病分册）》，包括呼吸系统结核病74例和肺外结核病35例（骨结核、颈淋巴结结核、结核性脑膜炎、结核性胸膜炎、结核性腹膜炎、支气管结核、泌尿系统结核以及盆腔结核等）。31例结核分枝杆菌培养阳性，21例痰涂片抗酸染色阳性，18例病理学诊断阳性。收集同期住院患者中支气管肺炎、大叶性肺炎、支气管扩张以及慢性支气管炎患者70例作为非结核组，男43例，女27例，年龄2～90岁，中位年龄59（36，80）岁。均根据临床症状、常规实验室检查、影像学表现以及治疗效果等证实，无结核病史和结核接触史。所有入选患者人类免疫缺陷病毒（HIV）筛查阴性、无急性病毒感染、无免疫抑制剂的应用以及妊娠。

1.2主要试剂和仪器结核分枝杆菌抗体（IgG）检测试剂盒（MP Biomedicals Asia Pacific）；QFT-GIT试剂盒、Sunrise酶标仪（澳大利亚Cellestis Limited公司）。离心机、振荡器，37℃恒温孵育箱及洗板机等，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3研究方法

1.3.1胶体金抗结核抗体（TB-Ab）检测采集患者肘正中静脉血3 mL于促凝管中，离心取上清25 μL至加样孔，待样本达到指示线时加3滴缓冲液，拉出标签，再加1滴缓冲液，15 min后观察结果。

1.3.2QFT-GIT试验在试验当天清晨采集患者肘正中静脉血3～4 mL于肝素锂抗凝管中，2 h内将混匀的全血分装至TB特异性抗原测试管、丝裂原阳性对照管以及空白对照管中（1 mL/管）。混匀后37℃恒温孵育16～24 h，4 000 r/min离心15 min，取上清行酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IFN-γ，采用Sunrise酶标仪进行读数。QFT-GIT试验结果判断标准：TB抗原测试管-空白对照管≥0.35 IU/mL，且≥25%空白对照管值，判断为阳性；阳性对照管-空白对照管≥0.50IU/mL，且TB抗原测试管-空白对照管＜0.35 IU/mL，判断为阴性；阳性对照管-空白对照管＜0.50 IU/mL，且TB抗原测试管-空白对照管＜0.35 IU/mL或空白对照管＞8.00 IU/mL，为不确定结果。结果计算和判定采用澳大利亚Cellestis Limited公司提供的A-QFT软件（版本2.62）。

1.4统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，绘图采用软件GraphPad prism 5.0。非正态分布计量资料采用M（P25，P75）表示，组间以及组内IFN-γ释放量比较采用Mann-Whitney U检验。采用诊断性试验比较2种方法的诊断价值，并绘制受试者工作特征（ROC）曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1QFT-GIT和TB-Ab试验在结核病诊断特性中的比较2种方法的检测结果见表1。QFT-GIT的诊断阳性率高于TB-Ab（2种方法诊断共同阳性64例，共同阴性62例，χ2=43.68，P＜0.01）。2种方法的诊断效能见表2。两者联合诊断时（串联）的敏感度降至52.29%（57/109），而特异度增加至90.00%（63/70）。

Tab.1The results of QFT-GIT and TB-Ab in two groups of patients表1　2组患者QFT-GIT与TB-Ab检测结果（例）

2.22组IFN-γ释放量比较排除假阳性和假阴性，阳性对照抗原（丝裂原）刺激下2组IFN-γ释放量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1A。经结核特异性抗原刺激下，结核组IFN-γ释放量高于非结核组（P＜0.01），见图1B。在结核组中，呼吸系统结核与肺外结核患者IFN-γ释放量比较，差异无统计学意义［4.08（0.58，7.72）IU/mL vs.4.56（0.69，9.93）IU/mL，U=1 250，P＞0.05］；确诊结核组与临床诊断结核病组比较，差异无统计学意义［4.58（0.78，7.60）IU/mL vs.3.80（0.88，10.00）IU/mL，U=1 122，P＞0.05］。

Fig.1The comparison of the expression quantity of IFN-γ between tuberculosis group and non-tuberculosis group图1　结核组与非结核组患者IFN-γ表达量的比较

2.3患者IFN-γ释放量ROC曲线曲线下面积（AUC）为0.913（95%CI：0.864～0.963）。根据ROC曲线得到的最佳阈值为0.265 IU/mL，此时QFT-GIT的敏感度为82.86%，特异度为96.33%，见图2。

Fig.2The ROC curve of IFN-γ release quantity图2　IFN-γ释放量ROC曲线

3　讨论

3.1临床检测结核病常用指标现状结核病的早期诊断和治疗对结核病的预后至关重要。目前诊断的金标准仍是细菌学检查，但由于痰涂片抗酸染色的敏感度低、结核分枝杆菌培养时间长等原因，很难满足临床早期诊断的需求。本实验痰涂片抗酸染色阳性率仅为19.27%（21/109），结核分枝杆菌培养阳性率为28.44%（31/109）。TST所使用的抗原是结核菌素纯蛋白衍生物（PPD），与BCG、非结核分枝杆菌存在交叉反应［5］，使TST的假阳性率增加，诊断特异度降低。

3.2QFT-GIT试验的特点QFT-GIT试验可直接检测全血中IFN-γ的释放量，无需分离淋巴细胞，在临床应用中具有操作简便、检测自动化等优点。2007年美国食品和药品管理局（FDA）批准QFTGIT试验用于诊断结核病感染，美国疾病预防控制中心最新指南中推荐用QFT-GIT代替TST用于结核病的诊断［6］。QFT-GIT试验使用的抗原是早期分泌靶抗原蛋白-6（ESAT-6）、培养滤液蛋白（CFP-10）以及RD11区编码的TB7.7，在BCG和大部分已知的非结核杆菌中普遍缺失，可避免交叉反应［7］，提高检测的敏感度和特异度，本研究中QFT-GIT试验检测结果略高于国外报道［8-9］。有研究表明在与TB患者接触的健康人中，有10%的QFT-GIT阳性接触者和0.4%的QFT-GIT阴性接触者最终发展成TB，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01），证明QFTGIT试验可作为TB阳性预测指标之一［10］。QFTGIT试验假阴性结果多见于结核合并免疫缺陷性疾病，包括肿瘤、慢性病毒感染、糖尿病、自身免疫性疾病、慢性肾功能衰竭以及长期服用免疫抑制剂的患者［11-13］。本研究7例假阴性患者中，4例结核分枝杆菌培养和痰涂片抗酸染色阳性，3例仅痰涂片抗酸染色阳性。在7例患者中，4例合并糖尿病，1例合并食管癌，1例合并慢性肾功能不全，但有1例无合并上述疾病，考虑为初次感染，T淋巴细胞无应答状态，IFN-γ的分泌量未达到检测下限［14］。非结核组有10例假阳性患者，经查证为肺癌、隐球菌感染性肺炎、低钾血症患者，其原因需进一步探究。

3.3QFT-GIT试验结果在2组中的差异2组标本经结核特异性抗原刺激后IFN-γ释放量差异有统计学意义，而经阳性对照抗原（丝裂原）刺激后无差异，避免了免疫功能状态差异影响QFT-GIT试验结果的混杂，从而保证结果的可靠性。IFN-γ释放量ROC曲线的最佳阈值为0.265 IU/mL，此时QFTGIT的敏感度为82.86%，特异度为96.33%。因此，QFT-GIT试验诊断结核病有较高的可靠性。QFTGIT试验诊断结核病的敏感度、准确度显著高于TB-Ab，两试验联合诊断的敏感度降至52.29%，而特异度增加至90.00%。特异度的增加可以有效地降低假阳性率，支气管扩张、肺炎等较结核病的预后好，如将其误诊为结核病，在进行抗结核治疗过程中会给患者带来巨大的伤害。因此，提高结核病诊断的特异度比敏感度更重要。

3.2QFT-GIT试验的优势QFT-GIT试验虽不能区分肺内结核病与肺外结核病，但可以用于结核病与其他呼吸系统疾病的鉴别诊断，且不受BCG的干扰，具有较高的敏感度和特异度，可用于临床结核病的诊断。QFT-GIT试验与国外常用的T-SPOT·TB方法相比，具有操作简便、快速，技术要求低，客观性强，自动化程度高等优点，可在医院推广使用，具有较高的临床应用价值。

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（2016-05-10收稿2016-06-20修回）

（本文编辑李鹏）

The diagnosis value of the whole blood interferon-γ release assay in tuberculosis

KONG Haifang1，YUE Na1，LIU Gang2，LI Yanchun1，TIAN Bin1，HU Zhidong1△
1 Department of Laboratory Medicine，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China；2 Tianjin Haihe Hospital Laboratory△

E-mail：huzhidong27@163.com

ObjectiveTo evaluate the clinical application of the whole blood interferon γ（IFN-γ）release assay of QuantiFERON TB Gold in tube（QFT-GIT）in diagnosis of tuberculosis.MethodsFrom October 2014 to October 2015，109 patients with tuberculosis（45 cases of confirmed patients and 64 cases of clinically diagnosed patients）and 70 patients with non-tuberculosis were enrolled in Tianjin Medical University General Hospital.In order to evaluate diagnosis value between two kinds of tests，and to compare the differences between two groups，QFT-GIT test and colloidal gold anti tuberculosis antibody（TB-Ab）were employed to detect in two groups of patients.The ROC curve of IFN-γ release quantity was analyzed in two groups.ResultsThe sensitivity and specificity of QFT-GIT were 93.58%and 85.71%respectively. The positive rate was significantly higher in QFT-GIT than that of TB-Ab（χ2=43.68，P＜0.01）.The sensitivity of combined detection of the two methods decreased to 52.3%（57/109），but the specificity increased to 90.0%（63/70）.The release quantity of IFN-γ was significantly higher in tuberculosis group than that in the non-tuberculosis group（U=330，P＜0.05）. The area under the ROC curve of IFN-γ release quantity was 0.913（95%CI:0.864-0.963）.ConclusionThe whole blood IFN-γ release assay of QFT-GIT is a sensitive and specific assay for detecting tuberculosis infection.The combination QFTGIT with TB-Ab can improve the specificity further，which could be a useful tool for the diagnosis of tuberculosis.

tuberculosis；BCG vaccine；diagnostic tests，routine；sensitivity and specificity；ROC curve；interferon-γ release assay；TB-Ab

R446.51，R52

A

10.11958/20160397

1天津医科大学总医院医学检验科（邮编300052）；2天津市海河医院检验科

孔海芳（1990），女，硕士在读，主要从事细菌耐药方面的研究

E-mail：huzhidong27@163.com