Nfic基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miR-20a靶向关系的验证

王珊，李晓霞，周杰，王宝利△

Nfic基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miR-20a靶向关系的验证

王珊1，2，李晓霞2，周杰1，王宝利1△

目的构建核因子C（nuclear factor I-C，Nfic）基因3′非编码区（3′UTR）荧光素酶报告质粒，利用双荧光素酶报告基因验证microRNA-20a（miR-20a）与其潜在靶基因Nfic的靶向关系。方法通过microRNA靶基因预测软件Targetscan获取miR-20a与Nfic基因3′UTR潜在的互补结合位点；PCR扩增出Nfic基因3′UTR序列，将此序列克隆至荧光素酶报告载体pMIR-Report Luciferase；将重组荧光素酶报告质粒与miR-20a mimics（实验组）或NC mimics（对照组）共同转染293-AD细胞，收集细胞后通过双荧光素酶报告系统检测2组细胞的荧光素酶活性，从而对Nfic与miR-20a的靶向调节关系进行鉴定。将miR-20a mimics和NC mimics分别转染骨髓基质细胞系ST2，裂解细胞提取蛋白后采用Western blotting检测NFIC蛋白的表达水平。结果构建的重组荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确。双荧光素酶报告基因检测显示，与对照组相比，miR-20a可以抑制Nfic 3′UTR报告基因载体的荧光素酶活性（P＜0.05）；Western blotting结果显示，与对照组相比，ST2细胞转染miR-20a mimics后NFIC蛋白表达水平明显下调。结论成功构建了Nfic基因3′UTR荧光素酶报告质粒，而miR-20a可以直接作用于Nfic基因3′UTR，抑制其荧光素酶活性。

微RNAs；3′非翻译区；miR-20a；Nfic；骨髓基质细胞系；荧光素酶报告基因

microRNAs是一类约22个核苷酸组成的种类丰富且进化保守的单链非编码小分子RNA，可以通过与靶基因mRNA完全互补配对而降解mRNA，或者与mRNA的3′非编码区（3′untranslated region，3′UTR）部分互补配对而阻断蛋白质翻译，从而实现基因表达的转录后调控［1-2］。本课题组前期研究证明microRNA-20a（miR-20a）可以通过靶向Kdm6b促进间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向成脂分化［3］。也有研究证实核因子C（nuclear factor I-C，Nfic）在骨髓MSCs向成骨细胞分化和骨形成中起着重要作用［4］。通过生物信息学预测发现Nfic也是miR-20a的潜在靶基因，本研究拟采用双荧光素酶报告基因检测、Western blotting等分子生物学技术验证miR-20a和Nfic之间的靶向关系，为进一步阐明miR-20a调节成骨分化的分子机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料细胞株293-AD及骨髓基质细胞系ST2细胞为本实验室保存；SPF级4周龄雄性C57小鼠购自军事医学科学院；胎牛血清及细胞培养基均购自Gibco公司；转染试剂Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司；miR-20a mimics及其阴性对照片段（NC mimics）由上海吉玛生物科技公司合成；鼠源NFIC单克隆抗体购自Immunoway公司；鼠源β-actin单克隆抗体购自proteintech公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG购自中杉金桥公司；双荧光素酶检测试剂盒、pMIR-Report Luciferase购自Promega公司；pEasy-T1购自北京Transgene公司。

1.2方法

1.2.1构建荧光素酶报告基因载体通过microRNA靶基因预测软件Targetscan获取miR-20a与Nfic基因3′UTR潜在的互补结合位点，设计成对PCR扩增引物，构建含有miR-20a应答序列的Nfic 3′UTR片段。Nfic引物上游5′-CTCGCACATGGAAGGTATCAG-3′，下游5′-CCACGTCATC AGGAGGGTCA-3′。

取C57小鼠1只，以小鼠肝脏DNA为模板进行PCR扩增反应，将得到的PCR产物与pEasy-T1载体进行连接，25℃连接10 min后转化感受态细胞DH5α，均匀涂于预先涂有异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的LB/氨苄青霉素的固体培养基上，进行蓝白斑筛选。37℃过夜培养后，挑取白色单菌落摇菌过夜，提取质粒命名为Nfic-3′UTR-T1。pMIR-Report Luciferase载体经限制性内切酶HindⅢ/PmeⅠ双酶切电泳回收大片段，Nfic-3′UTR-T1经HindⅢ/EcoRⅤ双酶切回收小片段，其中PmeⅠ和EcoRⅤ互为同尾酶。用T4 ligase将pMIR-Report Luciferase酶切回收的大片段与Nfic-3′UTR-T1酶切回收的小片段于16℃连接过夜，转化感受态细胞DH5α，均匀涂于LB/氨苄青霉素的固体培养基上，于固体培养板上挑取单菌落37℃摇菌过液，提取质粒命名为Nfic-Luc。用HindⅢ/SacⅠ进行双酶切鉴定，37℃反应15 min后，进行琼脂糖凝胶电泳。酶切鉴定正确后送测序，并将结果正确的克隆于-80℃保存。

1.2.2miR-20a与Nfic-Luc共转染293-AD细胞用含10%FBS的DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱内培养。转染前将细胞接种于24孔板中，待细胞汇合度达到40%～50%时进行转染。miR-20a mimics（实验组）及NC mimics（对照组）的终浓度为50 nmol/L，每孔分别加入0.5µg Nfic-Luc质粒及10 ng pRL-SV40报告基因载体。转染试剂采用Lipofectamine 3000。

1.2.3双荧光素酶活性检测转染40 h后，采用Dual-Luciferase Reporter Assay System进行检测。吸净各转染孔内的培养基，并用PBS清洗细胞1次。于各孔中加入100µL细胞裂解液，经过1次冻融反应后，收集各孔中的细胞裂解液，12 000 r/min离心1 min沉淀杂质。取20µL上述细胞裂解液于不透明96孔板各孔中，按照说明书依次加入萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶底物，通过多功能酶标仪进行检测。

1.2.4Western blotting实验当ST2细胞汇合度达到40%～50%时，分别转染NC mimics与miR-20a mimics，48 h后获取细胞，并加入适量的细胞裂解液，提取蛋白。BCA法进行蛋白质定量。10%SDS-PAGE凝胶，恒压电泳，恒流250 mA转膜2 h，室温封闭2 h，加入一抗后4℃孵育过夜，以β-actin为内参；1×TBST洗涤4次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h后，ECL化学发光法检测分析结果。

1.3统计学方法采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示，各组间均数比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1成功构建荧光素酶报告基因载体Nfic基因3′-UTR基因片段克隆到pMIR-Report Luciferase载体中，命名为Nfic-Luc。其酶切鉴定及测序结果均显示载体构建成功，见图1。

2.2双荧光素酶报告基因检测将miR-20a mimics与Nfic-Luc荧光素酶报告基因载体共转染293-AD细胞后，细胞荧光素酶活性显著下降，其活性实验组（0.56±0.03）较对照组（1.00±0.03）下降了44%，差异有统计学意义（n=3，t=17.272，P＜0.01）。

2.3Western blotting检测miR-20a对NFIC蛋白表达水平的影响对照组和实验组中NFIC/β-actin分别为0.76±0.04、0.36±0.01，差异有统计学意义（n=3，t=17.155，P＜0.05），见图2。

Fig.1Nfic-Luc construction was identified by enzyme digestion图1Nfic-Luc重组质粒双酶切鉴定

Fig.2NFIC protein level was down-regulated after the transfection of miR-20a mimics versus control mimics transfection图2　转染miR-20a mimics后NFIC蛋白表达水平较对照组降低

3　讨论

随着生活水平的提高，人均寿命的延长，骨质疏松、骨关节炎等疾病的发病率越来越高。MSCs是一类能自我更新、具有多向分化潜能的非造血干细胞，可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等方向分化［5-6］，且在体外扩增多代后仍可保持其多向分化潜能，对于骨质疏松、股骨头坏死等骨科疾病具有重要的临床治疗意义［7］。同时越来越多的研究表明，microRNA在MSCs向脂肪细胞和成骨细胞分化过程中起重要调节作用［8-10］。miR-17-92家族在组织和器官发育过程中不可或缺，历来被广泛研究，miR-20a就是其中一员。有研究显示miR-20a在结肠直肠癌中较旁黏膜表达升高，且与淋巴结转移和远处转移相关［11］；miR-20a表达增高可以使细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化延长，同时使异位基质细胞中几种血管生成基因表达上调［12］。本课题组前期研究证明miR-20a可以通过靶向Kdm6b促进MSCs的成脂分化［3］。生物信息学预测结果提示，Nfic也是miR-20a的潜在靶基因。

NFI家族转录因子是位点特异性的DNA结合蛋白，又被称为CTF或CAAT盒转录因子，主要包括NFIA、NFIB、NFIC和NFIX。Nfic缺失（Nfic-/-）鼠牙源性干细胞增殖减少，成牙本质细胞分化减弱而致磨牙根发育短小，说明Nfic对牙根形成具有关键调节作用；Nfic-/-鼠表现为严重的骨量减少，在Nfic-/-鼠的骨髓基质细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ的表达增加，促进其向脂肪细胞分化，减少成骨细胞分化［13］。有研究证明Nfic能直接调节成骨细胞特异性转录因子Osterix的表达并通过下游BMP2-Runx2信号通路起作用，影响骨髓基质细胞的成骨或成脂分化［4］。

为探究miR-20a对Nfic的调控作用，本研究首先将Nfic 3′UTR克隆到双荧光素酶报告载体上，然后与pRL-SV40报告基因载体、miR-20a mimics或NC mimics共同转染293-AD细胞，与对照组相比，miR-20a能与Nfic mRNA的3′UTR结合，明显抑制报告载体的荧光素酶活性。进一步研究发现，在ST2细胞中分别转染miR-20a mimics和NC mimics，miR-20a过表达能显著下调NFIC蛋白水平，表明miR-20a可以负性调节NFIC蛋白表达。以上实验证明Nfic是miR-20a的直接靶基因，提示miR-20a可能通过靶向调节Nfic的表达而控制MSCs的成骨或成脂过程，进而对骨或脂肪组织的发育产生影响。

有研究证明microRNA可以与某些成骨细胞或脂肪细胞调节基因的3′UTR结合从而抑制其表达，进而调节成骨或脂肪细胞的分化。如miR-214通过直接靶向结合激活转录因子4（activating transcription factor，ATF4）3′UTR，抑制成骨细胞活性，影响骨形成［14］；miR-144通过靶向调节钙黏蛋白11（Cad-11），抑制MSCs向成骨分化［15］；miR-3077-5p和miR-705分别通过靶向同源框基因A10（HOXA10）和转录因子Runx2，使MSCs向脂肪细胞分化［16］；miR-142-5p可通过靶向含有WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1（WW-domain-containing E3 ubiquitin proteinligase 1，Wwp1）提高成骨细胞活性和基质矿化［17］。本研究发现miR-20a过表达组中的荧光素酶活性较对照组下降了约44%，但仍有少量NFIC蛋白表达，表明miR-20a并未完全抑制Nfic的表达，提示还存在其他基因能够调控Nfic。因此，后续有必要深入研究是否有其他microRNAs与miR-20a协同调控Nfic的表达。

［1］Kim VN.Small RNAs：classification，biogenesis，and function［J］. Mol Cells，2005，19（1）：1-15.

［2］Macfarlane LA，Murphy PR.MicroRNA：biogenesis，function and role in cancer［J］.Curr Genomics，2010，11（7）：537-561.doi：10.2174/138920210793175895.

［3］Zhou J，Guo F，Wang G，et al.miR-20a regulates adipocyte differentiation by targeting lysine-specific demethylase 6b and transforming growth factor-beta signaling［J］.Int J Obes（Lond），2015，39（8）：1282-1291.doi：10.1038/ijo.2015.43.

［4］Lee DS，Choung HW，Kim HJ，et al.NFI-C regulates osteoblast differentiation via control of osterix expression［J］.Stem Cells，2014，32（9）：2467-2479.doi：10.1002/stem.1733.

［5］Eskildsen T，Taipaleenmäki H，Stenvang J，et al.MicroRNA-138 regulates osteogenic differentiation of human stromal（mesenchymal）stem cells in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（15）：6139-6144.doi：10.1073/pnas.1016758108.

［6］Bruder SP，Jaiswal N，Haynesworth SE.Growth kinetics，selfrenewal，andtheosteogenicpotentialofpurifiedhuman mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation［J］.J Cell Biochem，1997，64（2）：278-294.

［7］Dimitriou R，Jones E，Mcgonagle D，et al.Bone regeneration：current concepts and future directions［J］.BMC Med，2011，9：66. doi：10.1186/1741-7015-9-66.

［8］Li CJ，Cheng P，Liang MK，et al.MicroRNA-188 regulates agerelated switch between osteoblast and adipocyte differentiation［J］. J Clin Invest，2015，125（4）：1509-1522.doi：10.1172/JCI77716.

［9］Jeong BC，Kang IH，Hwang YC，et al.MicroRNA-194 reciprocally stimulates osteogenesis and inhibits adipogenesis via regulating COUP-TFII expression［J］.Cell Death Dis，2014，5：e1532.doi：10.1038/cddis.2014.485.

［10］Li H，Li T，Wang S，et al.miR-17-5p and miR-106a are involved in the balance between osteogenic and adipogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells［J］.Stem Cell Res，2013，10（3）：313-324.doi：10.1016/j.scr.2012.11.007.

［11］Zhang GJ，Li Y，Zhou H，et al.miR20a is an independent prognostic factor in colorectal cancer and is involved in cell metastasis［J］.Mol Med Rep，2014，10（1）：283-291.doi：10.3892/ mmr.2014.2144.

［12］Lin SC，Wang CC，Wu MH，et al.Hypoxia-induced microRNA-20a expression increases ERK phosphorylation and angiogenic gene expression in endometriotic stromal cells［J］.J Clin Endocrinol Metab，2012，97（8）：E1515-E1523.doi：10.1210/jc.2012-1450.

［13］Kim TH，Bae CH，Yang S，et al.Nfic regulates tooth root patterning and growth［J］.Anat Cell Biol，2015，48（3）：188-194.doi：10.5115/acb.2015.48.3.188.

［14］Wang X，Guo B，Li Q，et al.miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation［J］.Nat Med，2013，19（1）：93-100.doi：10.1038/ nm.3026.

［15］Kang X，Kang F，Yang B，et al.miRNA-144 inhibiting osteogenesis of mesenchymal stem cells by targeting cadherin-11［J］.J Third Mil Med Univ，2013，35（10）：922-926.［康夏，康菲，杨波，等.miRNA-144靶向调节钙粘蛋白11对间充质干细胞成骨分化的抑制效应［J］.第三军医大学学报，2013，35（10）：922-926］.

［16］Liao L，Yang X，Su X，et al.Redundant miR-3077-5p and miR-705 mediate the shift of mesenchymal stem cell lineage commitment to adipocyte in osteoporosis bone marrow［J］.Cell Death Dis，2013，4：e600.doi：10.1038/cddis.2013.130.

［17］Tu M，Tang J，He H，et al.MiR-142-5p promotes bone repair by maintaining osteoblast activity［J］.J Bone Miner Metab，2016 Apr 16.［Epub ahead of print］.

（2016-04-17收稿2016-05-12修回）

（本文编辑李国琪）

Construction of Nfic gene 3′UTR dual luciferase reporter vector and targeting verification between Nfic and miR-20a

WANG Shan1，2，LI Xiaoxia2，ZHOU Jie1，WANG Baoli1△
1 Key Laboratory of Hormones and Development（Ministry of Health），Metabolic Diseases Hospital&Institute of Endocrinology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Basic Medical College of Tianjin Medical University△

E-mail：bliwang72@163.com

ObjectiveTo construct a luciferase reporter vector containing the 3′untranslated region（3′UTR）of nuclear factor I-C（nuclear factor I-C，Nfic），and apply dual luciferase reporter gene system to determine the association between microRNA-20a（miR-20a）and its potential target gene Nfic.MethodsThe potential complementary binding sites of miR-20a and Nfic were predicted by Targetscan.The 3′UTR of Nfic fragment amplified by PCR was cloned into luciferase reporter vector MIR-Report Luciferase.The luciferase reporters containing 3′UTR of Nfic and miR-20 mimics（experimental group）or NC mimics（control group）were co-transfected into 293-AD cells.Cells were collected，and then dual-luciferase reporter assay was performed to detect the luciferase activity of the two groups of cells，consequently the relationship between miR-20a and Nfic was identified.The miR-20a mimics and NC mimics were transfected into marrow stromal cell line ST2 respectively.The total cell lysates were collected，and the expression level of NFIC was detected by Western blotting assay.ResultsResults of double enzyme digestion and DNA sequencing showed that sequence of luciferase reporter vector was correct.miR-20a specificity bounded to Nfic 3′UTR and inhibited the luciferase activity of the reporter construct（P＜0.05）.Western blotting assay showed that the NFIC protein level was obviously down-regulated in ST2 cells after the transfection of miR-20a mimics compared with that of control.ConclusionThe luciferase reporter vector containing the 3′UTR of Nfic is constructed successfully，which confirms that miR-20a can direct effect on Nfic3′UTR and repress its luciferase activity.

microRNAs；3′untranslated regions；miR-20a；nuclear factor I-C；marrow stromal cell line；luciferase reporter gene

R349.6

A

10.11958/20160318

国家自然科学基金资助项目（81271977，81472040）

1天津医科大学代谢病医院内分泌研究所、卫生部激素与发育重点实验室（邮编300070）；2天津医科大学基础医学院

王珊（1991），女，硕士在读，主要从事分子生物学与病原生物学研究

E-mail:bliwang72@163.com