基于SOAR1过量表达植物对ABA高耐受性的除草研究

姜上川 梅超 王小芳 张大鹏

摘要：为研究天然植物激素脱落酸（ABA）作为转基因植物选择性除草剂以实现环境友好型除草策略的可能性，采用改变拟南芥SOAR1基因表达的方法可以大幅度调控植物对ABA的耐受性，通过SOAR1基因过量表达获得对ABA耐受性高度增强的转基因植物。进一步通过植物在不同生长时期对ABA耐受性的试验检测ABA除草剂的有效浓度。结果表明，SOAR1过量表达转基因植物种子萌发和幼苗生长对ABA的耐受性超出了目前已知的极限，过量表达株系OE1、OE3和OE6所能够耐受ABA的最高浓度在种子萌发期为200 μM，在幼苗期生长期为500 μM。以最大限度抑制杂草生长发育和最少影响作物正常生长发育为前提，设定ABA除草剂的有效除草浓度范围在种子萌发期为3～100 μM，在幼苗生长期为10～200 μM。

关键词：脱落酸； SOAR1； ABA耐受性； 转基因植物； ABA除草剂

中图分类号：S451 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）05-1172-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.021

Potential Weed Control Based on High ABA Tolerance of SOAR1-overexpression Plants

JIANG Shang-chuan， MEI Chao， WANG Xiao-fang， ZHANG Da-peng

（ School of Life Sciences， Tsinghua University， Beijing 100084，China ）

Abstract： To study the potential eco-friendly weed control strategy with abscisic acid （ABA） as the selective herbicide for transgenic plants， we employed plant materials with changes in the expression level of SOAR1 which sharply regulate ABA tolerance in Arabidopsis. Transgenic plants with dramatically increased ABA tolerance can be obtained by overexpressing SOAR1. Additionally， a set of ABA tolerance assays during different growth stages were conducted to test the effective concentration of ABAs herbicidal activity. The results showed that the ABA tolerance of SOAR1-overexpression plants goes beyond the known extremity， and the highest endurable concentration of ABA for overexpression lines OE1， OE3 and OE6 was 200 μM during seed germination and 500 μM during seedling growth， respectively. With the precondition of maximum growth repression of weed and minimum growth inhibition of transgenic plants， the effective concentration range of ABAs herbicidal activity was 3～100 μM during seed germination and 10～200 μM during seedling growth， respectively.

Key words： abscisic acid （ABA）； SOAR1； ABA tolerance； transgenic plant； ABA herbicide

天然植物激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）参与调控植物生长发育各个阶段，包括种子休眠、萌发，幼苗生长、侧根生长、气孔运动以及营养生长向生殖生长转换等过程，并在植物对外界多种逆境胁迫的响应中起着重要作用[1-3]。

拟南芥中有450多个PPR（Pentatricopeptide repeats）基因家族成员。PPR蛋白在细胞内主要分布在线粒体、叶绿体或其他亚细胞结构内，参与细胞器mRNA的加工过程，包括剪切、剪接、稳定、RNA编辑以及蛋白质翻译起始和核糖体组装[4]。目前在拟南芥中已发现几个PPR蛋白参与了ABA信号转导过程，如PPR40[5]、ABO5[6]、SLG1[7]、PGN[8]与AHG11[9]等。所有这些PPR蛋白均定位在线粒体中，并可能通过调节细胞器中的活性氧产生来参与ABA信号转导。

清华大学生命科学学院实验室在拟南芥中发现的一种细胞质-核定位的PPR蛋白SOAR1参与ABA信号转导[10，11]。研究发现，改变SOAR1的基因表达可以大幅度调控植物对ABA的耐受性；尤其是SOAR1过表达植物种子萌发和幼苗生长对ABA的耐受性超出了目前已知的极限[10，11]。本研究通过SOAR1基因过量表达，获得对ABA耐受性高度增强的转基因植物，为天然植物激素ABA作为转基因植物的选择性除草剂、实现环境友好型绿色除草提供一种可能。

1 材料与方法

1.1 植物材料

①拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型（Col）种子购自美国俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心（ABRC）；②SOAR1基因表达调低的2个T-DNA插入突变体soar1-2和soar1-3种子购自凡尔赛遗传学和植物育种实验室拟南芥资源中心（http：//dbsgap.versailles.inra.fr/portail/），SOAR1（AT5G11310）基因T-DNA插入突变体soar1-2（FLAG_546D07）和soar1-3（FLAG_500B04），其遗传背景为Col生态型；③拟南芥野生型Col用于获得SOAR1转基因过表达植物。SOAR1过表达转基因植株OE1、OE3和OE6等为本实验室获得并保存；④ABI2 （AT5G 57050）转基因过表达植株ABI2-OE为本实验室保存[12]，ABI5（AT5G36270）功能缺失突变体abi5-1 （CS8105：abi5-1）为本实验室保存并与野生型Col回交。这两个遗传材料都是公认的ABA不敏感突变材料[12，13]，其中ABI2-OE对ABA强烈脱敏[10-12]。以上所有植物材料均经过了分子鉴定[10，11]。

1.2 植物生长条件

在超净工作台中，用0.5%（V/V）次氯酸钠溶液浸泡漂洗拟南芥种子15 min，再用无菌水漂洗5次，之后将种子播在MS固体培养基上。4 ℃低温层积处理3 d后，将平板放入光照培养箱生长10 d左右，将幼苗移栽到营养土中生长。光周期为16 h/8 h（光照/黑暗），温度为20～22 ℃，光照强度为120 μm/m2s。

2 结果与分析

2.1 SOAR1过量表达株系种子萌发期ABA除草浓度的选择区间

将拟南芥野生型Col、SOAR1过量表达株系OE1、OE3和OE6、SOAR1低表达突变体soar1-2和soar1-3、ABA不敏感對照ABI5功能缺失突变体abi5-1以及具有显著ABA脱敏表型的ABI2过量表达株系ABI2-OE种子直接播种在含有一系列不同浓度ABA （0、3、5、10、100和200 μM）的MS培养基上，4 ℃下低温层积3 d后移入光照培养箱中，14 d后观察幼苗对ABA的耐受情况，如图1-A所示。

在含0 μM ABA的MS培养基上，各遗传材料的幼苗生长差异不显著（图1-B）。从浓度3 μM ABA开始，突变体soar1-2和soar1-3与野生型Col表现出无法耐受，其生长发育状态基本停滞。而在10 μM ABA培养基上SOAR1过量表达转基因株系OE1、OE3和OE6幼苗的真叶与根系生长几乎不受ABA影响，其真叶与根系仍能正常生长发育，与无ABA（0 μM）培养基上生长状态接近。

在高达100 μM ABA的MS培养基上，拟南芥野生型Col被ABA强烈抑制，突变体soar1-2和soar1-3受抑制程度更高，基本上完全不萌发；而SOAR1过量表达转基因株系幼苗仍能正常生长出真叶与根系。SOAR1过量表达株系对ABA的耐受程度显著高于对ABA不敏感突变体abi5-1，并略高于ABI2过量表达株系ABI2-OE。在含有200 μM ABA的MS培养基上，SOAR1过量表达转基因株系OE1、OE3和OE6幼苗的生长受到ABA的抑制。

结果表明，在种子直接萌发生长条件下，突变体soar1-2和soar1-3与野生型Col（视同杂草）所能够耐受ABA的最高浓度为3 μM；过表达转基因株系OE1、OE3和OE6（视同作物）所能够耐受ABA的最高浓度为200 μM。考虑到ABA浓度要高到能足以抑制杂草种子萌发，又尽量减少对SOAR1转基因株系（作物）的萌发生长的影响，因此在种子萌发期，ABA除草剂的有效除草浓度范围为3～100 μM。

2.2 SOAR1过量表达株系幼苗生长早期ABA除草浓度的选择区间

如图2-A所示，将拟南芥野生型Col，SOAR1过表达株系OE1、OE3和OE6，SOAR1低量表达突变体soar1-2和soar1-3，ABA不敏感对照ABI5功能缺失突变体abi5-1以及具有显著ABA脱敏表型的ABI2过量表达株系ABI2-OE种子直接播种在正常MS培养基上，4 ℃下低温层积3 d，然后移入光照培养箱中生长48 h后，再将刚萌发的幼苗分别移入含有不同浓度ABA （0、 5、10、50、200和500 μM）的培养基上，生长12 d后观察幼苗生长的情况。

由图2-B可知，在含0 μM ABA的MS培养基上，各遗传材料的幼苗生长差异不显著。而从5 μM开始到10 μM ABA的MS培养基上，野生型Col、突变体soar1-2和soar1-3移苗生长后生长状态受到ABA强烈抑制（子叶不能变绿、根部几乎不能生长）。而在含有20 μM ABA的MS培养基上SOAR1过量表达株系OE1、OE3和OE6幼苗的真叶与根系生长状态几乎没有受到ABA的抑制，与无ABA的MS培养基上生长状态接近，其对ABA的耐受能力高于abi5-1以及ABI2过表达株系ABI2-OE。ABA不敏感突变体abi5-1受ABA抑制程度与野生型接近。

在200 μM ABA处理后，野生型Col、突变体soar1-2和soar1-3、ABA不敏感突变体abi5-1不能耐受ABA处理，几乎停滞生长；而SOAR1过量表达转基因株系OE1、OE3和OE6幼苗子叶仍能转绿，真叶与根系仍能生长，其对ABA耐受能力仍强于ABI2-OE。直到500 μM ABA处理后，SOAR1过量表达转基因株系OE1、OE3和OE6幼苗才能显现出受到ABA抑制的表型。

以上结果表明，在移苗生长条件下，突变体soar1-2和soar1-3与野生型Col（视同杂草）所能够耐受ABA的最高浓度为10 μM；过表达转基因株系OE1、OE3和OE6（视同作物）所能够耐受ABA的最高浓度为500 μM。如上所述，考虑到ABA浓度要高到能足以抑制杂草种子萌发，又尽量减少对SOAR1转基因株系的萌发生长的影响，因此在幼苗期生长早期，ABA除草剂的有效浓度范围应该为10～200 μM。

3 小結与讨论

本研究通过SOAR1过表达转基因拟南芥株系（视同作物）与野生型Col、SOAR1低表达突变体等（视同杂草），在不同生长时期对ABA耐受性的对比试验，ABA除草剂的有效除草浓度范围是以最大限度抑制杂草生长发育和最少影响作物正常生长发育为前提的试验数据。得出如下结论。

1）在种子萌发期，SOAR1表达调低的植物（杂草）所能够耐受ABA的最高浓度为3 μM；而SOAR1过表达转基因植物（作物）所能够耐受ABA的浓度高达200 μM。ABA除草剂的有效除草浓度范围可设定为3～100 μM。

2）在幼苗生长早期，SOAR1表达调低的植物（杂草）所能够耐受ABA的最高浓度为10 μM；而SOAR1过表达转基因植物（作物）所能够耐受ABA的浓度高达500 μM。因此ABA除草剂的有效除草浓度范围可设定为10～200 μM。

近年来现代化农业生产过程中化学除草剂的使用量日益增加，长期大量使用化学除草剂带来的有害化学物质残留造成严重环境污染，危及农业生态环境，不仅对作物产生药害，同时影响人畜健康，亟待采取有效措施加以控制。研究开发天然植物激素类（或激素类似物）除草剂，即利用植物生长调节剂（包括人工合成和提取的天然植物激素或激素类似物等），取代化学除草剂是未来的发展趋势。天然植物激素ABA抑制种子萌发和幼苗生长，可以利用这个特性开发出一种潜在的除草剂。但要用ABA作为除草剂，作物必须能耐受高浓度的ABA。SOAR1过表达转基因拟南芥株系表现为对ABA强烈脱敏，几乎完全阻断ABA信号传导，可以耐受高浓度的ABA。以上证据表明，通过获得SOAR1过表达转基因作物，为利用天然植物激素ABA作为环境友好型绿色除草剂提供了可能的选择。当然，过量表达SOAR1基因在作物中的表现，以及其他作物中的SOAR1类似基因的开发，还需要有进一步的研究资料。此外，ABA及其合成类似物的低成本也是生产上有用的前提条件。随着ABA发酵生产技术的突破，ABA工业化大规模生产必将为利用天然植物激素ABA除草在农业中推广应用奠定基础。可以预计，利用ABA作为转基因植物的选择性除草剂具有很高的经济效益和广阔的发展前景。

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