反相高效液相色谱法测定妇炎舒胶囊中丹酚酸B的含量

陈英红 周婷婷 王颖

[摘要] 目的 本实验建立妇炎舒胶囊中丹酚酸B的含量测定方法。 方法 采用反相高效液相色谱法，选择迪马C18 色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），以乙腈（A）-0.02%甲酸（B）为流动相进行梯度洗脱：0～15 min，39%～39%A；15～20 min，39%～100%A；20～35 min，100%～39%A；检测波长为286 nm。 结果 丹酚酸B进样量在0.2～1.2 μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系，r = 0.9999，平均回收率96.21%，RSD为2.13%（n = 6）。平均含量应为（1.559±0.249）mg/g。 结论 该测定方法灵敏度高、分离效果好，可以作为妇炎舒胶囊的质量控制方法。

[关键词] 妇炎舒胶囊；反相高效液相色谱法；丹酚酸B

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（c）-0150-03

Determination of Fuyanshu Capsules by RP-HPLC method

CHEN Yinghong ZHOU Tingting WANG Ying

Institute of Chinese Material Medical， Jilin Academy of Traditional Chinese Medicine and Material Medical Sciences， Jilin Province， Changchun 130012， China

[Abstract] Objective To establish a method of the determination of Salvianolic acid B in Fuyanshu Capsules. Methods The HPLC-wavelength detection was employed using a column of Dikma Diamonsil C18 analytical column （5 μm，4.6 mm×250 mm） with a mobile phase of acetonitrile （A）-0.02% formic acid （B）. The gradient elution program was as follows： 0-15 min， 39%-39%A； 15-20 min， 39%-100%A； 20-35 min， 100% -39%A. The detection wavelength was set at 286 nm. Results The linear relationship was good within the concentration range of 0.2-1.2 μg （r = 0.9999）. The average recovery was 96.21% （RSD = 2.13%）. The average content was （1.559±0.249）mg/g. Conclusion The method was of high efficiency and sensitivity， which can be used effectively for the quality control of Fuyanshu Capsules.

[Key words] Fuyanshu Capsules； Reversed phase high-performance liquidchromatography； Salvianolic acid B

妇炎舒胶囊（批准文号：z20130272）为吉林省中医药科学院的院内制剂，具有清热利胆、化瘀止痛的功效。临床用于治疗盆腔炎、附件炎效果显著，深受广大患者欢迎。处方由黄芪、当归、丹参、党参、延胡索、三棱、莪术、没药、野菊花、土鳖虫、连翘、大贝12味药组成，丹参为方中主药，具有活血祛瘀、通经止痛的功效[1]，丹参的化学成分分为水溶性和脂溶性两大类，水溶性成分主要为酚酸类成分[2-9]。在已发表文献中未见有关妇炎舒胶囊的含量测定报道。本实验选取丹参中主要有效成分丹酚酸B为妇炎舒胶囊的指标成分，建立了丹酚酸B含量测定方法，用于控制该制剂的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2010C液相色谱仪（日本岛津分析仪器有限公司）；CLASS-VP工作站（日本岛津分析仪器有限公司）；AB204-N分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-50B 超声波清洗机（功率50 W，频率40 kHz，昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与试药

丹酚酸B对照品（批号：111562-200605）购于中国药品生物制品检定所。妇炎舒胶囊由吉林省中医药科学院制剂室制备（批号：20131204、20131205、20131206）。D101型大孔吸附树脂（天津浩聚树脂科技有限公司），水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取丹酚酸B对照品10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，摇匀，即得（每毫升含丹酚酸B 0.1 mg）。

2.2 供试品溶液的制备

取样品1 g，加入50 mL 70%乙醇溶解，超声30 min，滤过，滤液浓缩至5 mL加至已经处理好的D101型大孔吸附树脂柱（1.5 cm×12 cm），先以100 mL水洗，弃去水洗液，继以70%乙醇50 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL[10-13]。

2.3 阴性对照样品溶液的制备

按照处方比例制备除丹参的阴性样品，再按照“2.2”项下的方法制备阴性对照样品溶液。

2.4 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈（A）-0.02%甲酸（B）为流动相进行梯度洗脱：0～15 min，39%～39%A；15～20 min， 39%～100%A；20～35 min，100%～39%A，检测波长为286 nm，柱温35℃，流速0.9 mL/min，进样量10 μL。理论塔板数按丹酚酸B计算应不低于4500。结果见图1～3。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密吸取丹酚酸B对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，加甲醇稀释定容至10 mL容量瓶中。分别精密吸取上述溶液各20 μL注入液相色谱仪测定，以进样量（μg）对峰面积绘制标准曲线。丹酚酸B回归方程为Y=1 101 220.247X-658.785（r = 0.9999）。结果表明，在上述色谱条件下，丹酚酸B进样量在0.2～1.2 μg范围内，峰面积与进样量呈良好的线性关系，符合外标法定量测定的要求。

2.5.2 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，照上述色谱条件连续重复进样6次，测定平均峰面积为1 157 819，RSD值为1.33%，说明仪器整个系统精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 精密吸取供试品溶液10 μL。照上述色谱条件分别于0、4、8、12、16、20 h进样，测定平均峰面积为1 130 727，RSD值为1.48%，表明供试品溶液在20 h内稳定。

2.5.4 重复性试验 精密称取同一批号样品内容物6份，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，再按“2.4”项下色谱条件进样分析，样品测定丹酚酸B含量为1.385 mg/g，RSD = 1.10%，表明本研究制订的方法重复性良好。

2.5.5 回收率试验 精密称取同一批号的已知含量的样品（丹酚酸B的含量为1.385 mg/g）6份，分别加入对照品溶液2 mL（浓度0.35 mg/mL），按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，再按“2.4”项下色谱条件进样分析，计算回收率，结果见表1。平均回收率为96.21%，RSD = 2.13 %。表明该方法回收率较高、准确度高。

表1 回收率试验测定结果

2.6 3批样品含量测定

采用正文方法处理样品，进行含量测定，3批样品含量测定结果分别为1.801、1.524、1.351 mg/g。测定结果表明，妇炎舒胶囊中丹酚酸B含量基本稳定。 3 讨论

3.1 不同流动相考察

参考文献[14-22]，实验对4种流动相系统①甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59），②乙腈∶0.1%磷酸（21∶17），③甲醇-甲酸-水（40∶1∶59），④乙腈-0.02%甲酸（39∶61）的分离效果进行了考察，结果发现在流动相中加入少量酸可以改善峰形及分离度，分析结果显示乙腈-0.02%甲酸（39∶61）分离效果较好，保留时间适中，分离度符合要求。但在实验中发现连续多次进样后， 样品重现性不好，分析原因可能是供试品药味较多，成分复杂，直接采用乙腈-0.02%甲酸（39∶61）等度洗脱，有很多成分吸附在色谱柱上洗脱不下来，为了延长色谱柱的使用寿命，同时保证样品的重现性和分离效果，在指标成分丹酚酸B出峰后，采用梯度洗脱，在运行时间0-15-20-35 min，乙腈比例由39%-39%-100%-39%，对色谱柱进行清洗。

3.2 提取方法考察

根據丹酚酸B的性质，本试验选用不同浓度的乙醇、甲醇作溶剂对本品进行前处理，试验结果表明采用70% 的乙醇作溶剂，超声30 min能完全提取待测成分，但杂质峰有干扰，分离效果达不到要求，于是将提取液通过D101型大孔吸附树脂柱作纯化处理， 分析结果显示，该处理方法分离度高，平均回收率及重现性均较好。

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（收稿日期：2015-10-11 本文编辑：赵鲁枫）