米邦塔仙人掌果胶对小鼠慢性不可预知温和应激模型学习记忆的影响

余玲 肖同楚 屈亚莉 湛进进 郭莲军

[摘要] 目的 研究本实验室分离提取的米邦塔仙人掌果胶（MCP）对小鼠慢性温和应激（CUMS）模型学习记忆影响。 方法 采用Morris水迷宫（MWM）对60只小鼠进行筛选后按照随机数字表分为5组（每组12只）：正常对照组、CUMS模型组、MCP低剂量组（50 mg/kg）、MCP中剂量组（100 mg/kg）、MCP高剂量组（200 mg/kg）。建立CUMS模型，造模结束96 h后进行MWM实验。 结果 学习训练结束时，模型组小鼠逃逸潜伏期和游泳总路程显著长于对照组（P < 0.01），在靶标象限游泳路程/游泳总路程和穿越平台次数均明显低于对照组（P < 0.05或P < 0.01），MCP中、高剂量组小鼠逃逸潜伏期与模型组比较，差异有统计学意义（P < 0.01），游泳总路程与模型组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），穿越平台的次数显著增加（P < 0.05），而模型组、MCP各剂量组的小鼠游泳速度比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 MCP對CUMS小鼠学习记忆具有一定的改善作用。

[关键词] 米邦塔仙人掌果胶；慢性不可预知温和应激；学习记忆；小鼠

[中图分类号] R965 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（c）-0014-05

Effect of milpa alta cactus pectin on learning and memory in mice exposed to chronic unpredictable mild stress

YU ling1 XIAO Tongchu1 QU Yali2 ZHAN Jinjin3 GUO Lianjun3

1.Department of Obstetrics and Gynecology and Chronic Disease Management， Yiling District Maternal and Child Health Hospital， Hubei Province， Yichang 443100， China； 2.Department of Interventional Ultrasound， Wuhan Medical Treatment Center， Hubei Province， Wuhan 430023， China； 3.Department of Pharmacology， School of Basic Medical Sciences， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Hubei Province， Wuhan 430030， China

[Abstract] Objective To explore the effect of milpa alta cactus pectin （MCP） on learning and memory in mice exposed to chronic unpredictable mild stress （CUMS）. Methods A total of 60 qualified mice selected by Morris water Maze （MWM） were randomly divided into 5 groups using the random number table （12 mice in each group）； Control group， CUMS group， MCP low dose group （50 mg/kg）， MCP medium dose group （100 mg/kg）， and MCP high dose group （200 mg/kg）. The MWM test was conducted to evaluate the ability of learning and memory in 96 hours after the mice were exposed to CUMS. Results At the end of learning acquisition， compared with the control group， the escape latency and total swimming distance of CUMS group were significantly increased （P < 0.01）， while the target quadrant swimming distance/total swimming distance and the time of crossing platform were significantly decreased （P < 0.05）. Compared with CUMS group， MCP in medium dose group （100 mg/kg） and high dose group （200 mg/kg） significantly reduced the escape latency （P < 0.01） and the total swimming distance （P < 0.05）， but not for the target quadrant swimming distance/total swimming distance （P > 0.05）. CUMS and MCP treatment had no effect on the swimming speed in mice （P > 0.05）. Conclusion MCP shows an improving effect on learning and memorizing in mice exposed to CUMS.

[Key words] Milpa alta cactus pectin； Chronic unpredictable mild stress； Learning and memory； Mice

慢性不可預知温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型能很好地模拟人类抑郁症中慢性、低水平应激可导致的疾病发生，是一种用于研究疾病发生的良好动物模型[1]。CUMS造模过程中所用的各种应激因子能较好地模拟人类抑郁症状的发生[2]；同时也能较好地模拟抑郁患者其他的一些神经系统功能改变，如认知能力下降等；大量研究证实，CUMS导致海马依赖性认知功能损伤[3-5]。目前国内外研究者广泛应用此模型评价药物对抑郁症及相关学习记忆损伤的改善作用[6-7]。果胶（Pectin）是一种复杂的多糖，其主要成分是部分甲酯化的a（l，4）-D-聚半乳糖醛酸[8]，大量研究显示多种植物果胶有较好的抗氧化、抗炎、抗溃疡、抗癌和调节免疫的作用[9-12]。关于米邦塔仙人掌果胶（MCP）对中枢系统的影响报道较少。因此本文探讨MCP对慢性温和型应激模型小鼠学习记忆是否有改善作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

MCP，棕色粉末，由华中科技大学同济医学院药理学系提取，用双蒸水溶解配制成低、中、高三种浓度（5、10、20 mg/mL），调节pH值至中性。水迷宫试验系统及分析软件（中国医学科学院药物研究所）。

1.2 实验动物与分组

15～20 g清洁级的健康雄性昆明种小鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供[许可证号：SCXK（鄂）2008-0007，合格证号：00020736]，动物饲养：12 h昼夜交替，室温（24±2）℃，空气湿度（50±10）%，除造模及必要的断水断食外，小鼠均可自由进水进食。

采用Morris水迷宫（MWM）检测小鼠空间学习记忆能力，将筛选合格的60只小鼠按随机数字表法分为5组（每组12只，造模前各组小鼠学习记忆能力比较，差异无统计学意义）：①正常对照组；②CUMS模型组；③MCP低剂量组（50 mg/kg）；④MCP中剂量组（100 mg/kg）；⑤MCP高剂量组（200 mg/kg）。正常对照组：不进行任何应激处理；模型组：持续6 周给予1.3中的应激处理；果胶处理组：各组均进行应激处理，期间每天上午9：00～10：00灌胃给药，灌胃体积为0.1 mL/10 g，模型组给予同等体积的双蒸水。

1.3 慢性不可预知温和应激模型制备

在造模过程包括以下11种应激因子：①断水16 h时，②断食16 h，③45°倾斜鼠笼4 h，④潮湿垫料24 h，⑤通宵照明，⑥2 h-2 h时昼夜交替，⑦昼夜颠倒，⑧陌生气味4 h，⑨4℃水温游泳，⑩陌生气味4 h，■活动限制2 h。以周为时间单位，每天给予2～3种不同刺激因子进行应激，每次应激时间间隔48 h，应激处理共历时6周。

1.4 Morris水迷宫实验

在一间光线均匀的实验室内，所有陈设位置相对固定。实验前，先将小鼠放在实验室1 h以适应。实验条件：室温25℃，水温18～22℃。通过摄像系统实时拍摄小鼠的游泳轨迹，然后经计算机系统软件计算游泳速度及游泳总路程等。

实验分两部分进行，①定位航行实验：小鼠每天训练4次，连续训练5 d，在10：00～14：00进行实验。实验时小鼠分别从4个不同的入水点，并将小鼠头朝游泳桶壁入水，任其游泳，直到找到平台，每次训练间隔为10 min。设定每次试验时间为60 s，小鼠在60 s内达到平台的时间即逃逸潜伏期被记录下来；如果60 s内没能找到平台的记其潜伏期为60 s。②空间探索实验：实验第6天12：00进行空间探索实验，撤出平台，设定试验时间为30 s，小鼠从第4象限中间点入水，记录小鼠穿越目标区域的次数。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件处理实验数据，实验数据均以均数±标准差（x±s）表示，重复测量实验数据采用方差分析并结合LSD检验或Tamhane's T2检验比较各指标的组间差异，单因素方差分析并结合LSD检验比较空间探索实验中采用组间差异，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MCP对小鼠CUMS损伤空间学习记忆能力的影响

小鼠在连续训练5 d的过程中，发现在训练的第1天，各组小鼠寻找靶标所需时间较长，而经过训练后，各组小鼠寻找靶标的时间均有缩短。结果发现从第2天起，CUMS模型组明显长于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。在训练第5天，MCP中、高剂量处理组小鼠逃逸潜伏期显著低于CUMS模型组（P < 0.01）。见表1。

2.2 MCP对小鼠CUMS模型游泳速度的影响

从实验数据中可以看出，学习训练第1天，各组小鼠游泳速度均较快，随着训练次数的增加从第2天开始，各组游泳速度趋于稳定。学习训练第5天，正常对照组、CUMS模型组、MCP各剂量组的游泳速度之间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.3 MCP对小鼠CUMS模型游泳总路程的影响

实验发现小鼠在训练第1天，绕迷宫壁游泳的时间较长，导致游泳总路程较长；随着训练次数的增加，小鼠在入水后就有目的性的向着平台方向游去，其游泳总路程缩短。在训练第5天，CUMS模型组的游泳总路程与正常对照组比较差异有统计学意义（P < 0.01）；而MCP中、高剂量组的游泳总路程显著短于CUMS模型组（P < 0.05）。见表3。

2.4 MCP对小鼠CUMS模型在目标象限游泳路程/游泳总路程的影响

本实验结果发现，小鼠在训练第5天，CUMS模型组小鼠在目标象限游泳路程/游泳总路程正常对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；CUMS模型组、MCP各剂量组小鼠在目标象限游泳路程/游泳总路程，组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表4。

2.5 MCP对小鼠CUMS空间记忆能力的影响

空间探索实验通过检测30 s内小鼠穿越靶标所在区域的次数评价小鼠的空间记忆能力。本结果发现，正常对照组，CUMS模型组，MCP低、中、高剂量组次数分别为（2.69±0.44）、（1.50±0.27）、（1.70±0.42）、（2.60±0.27）、（2.70±0.42）次。CUMS模型组小鼠穿越越平台次数与正常对照组比较（P<0.01）；而MCP中、高剂量组小鼠穿越次数与CUMS型组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

MWM实验目前被广泛用于评价啮齿目动物的空间学习记忆能力的一种研究手段，已有文献报道CUMS模型损伤动物空间学习记忆能力[7]，故本实验中用MWM评价MCP对CUMS小鼠空间学习记忆能力的改善作用。已有临床报道，抑郁症患者往往伴有典型的学习记忆能力减退[13]，获取的信息在存储和再提取过程中显示出异常。本实验通过水迷宫实验发现，小鼠经过一段时间慢性不可预知应激后，寻找目标的时间（即逃逸潜伏期）明显延长，与正常对照组比较，差异有统计学意义；提示小鼠空间学习能力减退。另一方面，通过检测小鼠在靶标象限的穿越次数，也就是空间探索试验，发现CUMS模型组小鼠在靶标象限穿越的次数与正常对照组，明显减少，表明小鼠经慢性不可预知应激后，在空间学习能力减退的同时，空间记忆能力也受到损伤。而且通过检测小鼠在目标象限的游泳总路程/游泳总路程，发现CUMS模型组与正常对照组游泳速度和游泳总路程与正常对照组比较，差异无统计学意义；在目标象限的游泳总路程与游泳总路程的比值亦明显增加，说明慢性应激损伤对小鼠运动能力并无明显影响，而对学习记忆能力损伤更为明显，与文献报道一致[14-15]。有关慢性应激损伤对空间学习记忆的影响，也有不同的报道，认为可使学习记忆能力增强[16]，其原因可能与使用的动物种系和应激方式不同有关。

国外研究显示，仙人掌具有神经保护和提高长期记忆的作用，其机制可能是提高了脑源性神经营养因子（BDNF）、磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（CREB）、磷酸化细胞外信号调节激酶（pERK）的表达水平[17-19]。李萬铭等[20]报道仙人掌多糖可剂量依耐性改善慢性脑低灌注导致的小鼠学习记忆功能减退，明显改善小鼠海马CA1区细胞形态学和细胞存活率；潘建萍等[21]发现仙人掌多糖能够减轻缺氧/缺糖再给氧所致大鼠海马神经细胞的凋亡作用，其机制可能与其增强机体的抗自由基抗氧化能力有关。李莉梅等[22]发现野生仙人掌多糖对DPPH·、N02-有较强的清除作用，并具有一定的还原能力，该团队认为这是一种具有开发潜力的抗氧化、防衰老的功能性食品或药物。本研究结果显示米邦塔仙人掌果胶100 mg/kg和200 mg/kg不影响小鼠游泳速度影响，但显著降低CUMS小鼠逃逸潜伏期、游泳总路程，而且呈现剂量依赖性，表现出良好的学习记忆保护作用。

综上所述，CUMS模型可导致动物抑郁行为，并表现出明显的学习记忆能力的降低。给予MCP治疗后能显著改善抑郁模型动物的行为学与学习记忆能力的异常，表现出改善抑郁造成的认知功能损伤的作用，其具体机制有待进一步研究。

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（收稿日期：2015-10-30 本文编辑：赵鲁枫）