TTA1—Tat—PEG—GS NPs结合siRNA—EGFR转染C6细胞抑制EGFR基因表达的研究

胡洋 张龙 李旺 魏峰 丰伟 田新华

[摘要] 目的 探討TTA1、Tat、聚乙二醇（PEG）修饰的明胶硅氧烷纳米粒子（GS NPs）结合siRNA-EGFR转染C6细胞，抑制其表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响。 方法 根据鼠EGFR的mRNA序列设计合成siRNA-EGFR以及阴性对照siRNA-Scr（无意义序列）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs通过静电作用结合siRNA。实验分4组：Control组、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组及X-tremeGene/siRNA-EGFR组。除Control组外，其余三组均在体外对C6细胞进行转染。Real-time PCR、Western blot分别检测细胞EGFR mRNA及蛋白表达情况；CCK-8法、流式细胞仪分别检测细胞增殖和凋亡情况。 结果 与Control组及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组比较，TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组在体外细胞水平上能有效抑制C6细胞EGFR mRNA及蛋白的表达（P < 0.01），同时抑制C6细胞的增殖（P < 0.05或P < 0.01）并促进其凋亡（P < 0.01）。此外，X-tremeGene/siRNA-EGFR组和TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组在下调C6细胞EGFR水平、抑制细胞增殖及促进细胞凋亡方面差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 TTA1-Tat-PEG-GS NPs可能成为一种新型的基因治疗载体，为胶质瘤基因治疗的进一步研究提供理论依据。

[关键词] 胶质瘤；纳米粒子；基因载体；RNA干扰

[中图分类号] R739.41 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（c）-0004-05

Research of TTA1-Tat-PEG-GS NPs combined with siRNA-EGFR in transfection of C6 cells and inhibiting its EGFR gene expression

HU Yang1 ZHANG Long1 LI Wang1 WEI Feng2 FENG Wei2 TIAN Xinhua2

1.Medical College， Xiamen University， Fujian Province， Xiamen 361004， China； 2.Department of Neurosurgery， Zhongshan Hospital Affiliated to Xiamen University， Fujian Province， Xiamen 361004， China

[Abstract] Objective To investigate the property of TTA1-Tat-PEG modified gelatin-siloxane nanoparticles （GS NPs） combined with siRNA-EGFR in transfection of C6 cells and inhibiting its EGFR gene expression. Methods The siRNA-EGFR and negative control sequences （siRNA-Scr） were designed and synthesized according to the EGFR mRNA sequence of rats. TTA1-Tat-PEG-GS NPs bound to siRNA via electrostatic interaction. The composites of experiment included control group， TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr group， TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR group and X-tremeGene/siRNA-EGFR group. C6 cells were transfected in all groups except for those in the control group. Real-time PCR and Western blot were used to detect EGFR mRNA and protein levels， respectively. The proliferation and apoptosis were detected with CCK-8 and flowcytometry， respectively. Results Compared with control group and TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr group， TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR group could inhibit the expression of EGFR mRNA and protein of C6 cells （P < 0.01）， restrain the proliferation of C6 cells （P < 0.05 or P < 0.01） and promote its apoptosis （P < 0.01）. In addition， there were no statistically significant differences between X-tremeGene/siRNA-EGFR group and TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR group in decreasing the EGFR levels of C6 cells， inhibiting the cell proliferation and promoting the cell apoptosis （P > 0.05）. Conclusion TTA1-Tat-PEG-GS NPs may be a novel gene carrier and provide theoretical foundation for the further research of glioma gene therapy.

[Key words] Glioma； Nanoparticles； Genetic vector； RNA interference

胶质瘤是最常见的颅内恶性脑肿瘤之一，整体的预后及治疗效果不理想[1-2]，寻找有效的治疗方法成为当务之急。近年来，基因治疗胶质瘤研究成为一大热点[3]，RNA干扰（RNAi）就是基因治疗中极具前景的手段之一[4]。表皮生长因子受体（EGFR）在促进肿瘤细胞增殖及抑制凋亡等方面均发挥重要作用[5]。Wang等[6]认为，EGFR在恶性胶质瘤细胞中常出现扩增、突变以及过表达。应用RNAi降低胶质瘤细胞EGFR的表达，有望成为一个重要的治疗途径[7]。基因治疗的关键因素之一是基因载体，目前主要使用的载体为病毒载体[8]，但由于其安全性差、靶向能力差等原因限制了其应用[9]，因此非病毒基因载体成为一条新的研究途径[10]，然而能具備跨血脑屏障及高效基因转染能力的非病毒基因载体仍不多见[11-12]。GSNPs是一种新颖的纳米复合物，以GSNPs为载体骨架，修饰上可延长循环时间的聚乙二醇（PEG），并通过ERP效应（选择性高通透性和滞留性）在肿瘤组织中蓄积[13-14]；在修饰上具有高特异性靶向胶质瘤细胞的适配体TTA1[15]和具有强效穿膜能力的Tat[16]，设计成新型的TTA1-Tat-PEG-GS NPs基因载体。本研究以高表达EGFR的C6细胞为实验对象，以TTA1-Tat-PEG-GS NPs为载体结合siRNA，在体外转染C6细胞干扰EGFR基因表达，从而证明TTA1-Tat-PEG-GS NPs可作为一种新型的基因载体，为胶质瘤基因治疗的进一步研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

C6细胞购于上海美轩公司；明胶购于美国BBI公司；PEG购于美国DOW公司；适配体TTA1（CCTGCACTTGGCTTGGATTTCAGAAGGGAGACCC）、Tat（KYGRRRQRRKKRGC）多肽购于上海生工公司。X-tremeGene转染试剂购于北京索莱宝公司；Trizol购于美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒以及Real-time PCR试剂盒购于日本Takara公司；抗体购于美国Abcam公司；CCK-8试剂盒购于天津百萤生物公司；ANNEXINV/PI试剂盒购于北京拜尔迪生物公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的设计与合成 根据Genbank提供的鼠EGFR mRNA序列（NM_031507.1），设计靶向EGFR mRNA的序列为5'-GGAATTATGACCTTTCCTT-3'，阴性对照序列（Scramble）为5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'，委托上海吉玛公司合成相应siRNA。

1.2.2 TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA的结合及结合比例选择 参考Wang等[17]及张龙等[18]方法合成GS NPs，依次修饰上PEG、TTA1、Tat，得到TTA1-Tat-PEG-GS NPs，再结合siRNA。琼脂糖凝胶电泳检测TTA1-Tat-PEG-GS NPs与siRNA的结合能力：两者分别以20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1的质量比制备悬液，均匀混合后上样至琼脂糖凝胶开始电泳，电压80 V，时间20 min。分别取上述TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA复合物悬液置于表面电位仪上，测定表面粒径、分散系数和电位。

1.2.3 C6细胞的转染 实验分四组：Control组（正常培养的C6细胞），TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组（TTA1-TAT-PEG-GS NPs转染Scramble序列），TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组（TTA1-Tat-PEG-GS NPs转染EGFR干扰序列）及X-tremeGene/siRNA-EGFR组（X-tremeGene Reagent转染EGFR干扰序列）。取对数生长期细胞1.0×105/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁达0.50融合度后，TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组细胞更换无血清培养基，分别加入TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scramble及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR复合物（根据方法“1.2.2”结果确定结合比例），共培养10 h更换新鲜培养基继续培养。X-tremeGene/siRNA-EGFR组转染严格按照X-tremeGene说明书中操作指南进行。

1.2.4 Real-time PCR检测C6细胞EGFR mRNA水平 转染48 h后，分别消化收集各组细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，并按照TaKaRa试剂盒说明进行操作。实验均重复3次（扩增EGFR的引物为：上游5'-GCCACAGGTTCCGAGATGAA-3'，下游5'-CCACGTAGTTTCTGGGGCAT-3'。用β-actin作内参，其引物序列为：上游5'-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3'，下游5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'）。

1.2.5 Western blot检测C6细胞EGFR蛋白表达水平 转染72 h后，分别消化收集各组细胞，离心弃去上清后加入RIPA细胞裂解液以及蛋白酶抑制剂PMSF。置于冰上30 min，4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清测定蛋白浓度。取50 μg蛋白加入到上样缓冲液中，经100℃金属浴加热5 min变性后用SDS-PAGE电泳。常规转膜及封闭后，分别加入抗EGFR或β-actin的一抗，4℃孵育过夜。TBST洗脱10 min×3次，加入二抗室温孵育1 h，再用TBST洗脱10 min×3次。硝酸纤维素膜加入显色液后，ECL化学发光显像，图像分析仪分析结果。实验均重复3次。

1.2.6 CCK-8实验检测C6细胞增殖能力 转染48 h后，分别消化收集各组细胞，调整密度至5×104细胞/mL，各取100 μL细胞悬液/孔加入到5个96孔板中，每组设3个复孔。24 h后，取出1个96孔板，往每孔中加入10 μL CCK8试剂，37℃培养箱中继续培养4 h，用酶标仪测定450 nm处吸光值。每隔24 h采用同样的方法取1个96孔板检测，连续测5 d。

1.2.7 流式细胞术检测C6细胞的凋亡 转染48 h后，分别消化收集各组细胞，调整密度至1×106细胞/mL，取0.5 mL细胞悬液，室温1200 r/min离心3 min，去上清后再用200 μL预冷的1×结合缓冲液轻轻重悬。加入10 μL AnnexinV-FITC，室温避光反应15 min，室温1000 r/min离心5 min，洗涤1次，用500 μL 1×结合缓冲液重悬细胞，加入10 μL碘化丙啶（PI），4℃避光孵育30 min，用流式细胞仪检测分析凋亡情况。实验均重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行数据处理，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TTA1-Tat-PEG-GS NPs与siRNA的结合比例

当TTA1-Tat-PEG-GS NPs与siRNA的质量比为100时，TTA1-Tat-PEG-GS NPs可将siRNA完全结合（图1）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA的表面电位随着TTA1-Tat-PEG-GS NPs与siRNA质量比的增高而增加，同时粒径相应减小（表1）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA以100∶1的质量比进行结合时，复合物粒径较小，表面电位较高，可完全结合siRNA。

条带1：mark；条带2：siRNA；条带3、4、5、6、7：TTA1-Tat-PEG-GSNPs与siRNA的质量分别比为20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1

图1 琼脂糖凝胶电泳实验检测TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA

结合性

表1 TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA纳米粒子粒径、分散系数

和Zeta电位（x±s）

2.2 Real-time PCR检测C6细胞中EGFR mRNA的相对表达量

Control组、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组及X-tremeGene/siRNA-EGFR组EGFR的mRNA相对表达量分别为（1.005±0.057）、（1.002±0.076）、（0.287±0.022）及（0.249±0.036）（图2）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组表达水平较Control组及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组明显下调（P < 0.01），而与X-tremeGene/siRNA-EGFR組差异无统计学意义（P > 0.05）。

**P < 0.01

图2 Real-time PCR检测四组C6细胞中EGFR mRNA的表达水平

2.3 Western blot检测C6细胞中EGFR蛋白的表达

TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组蛋白的表达水平较Control组及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组明显下调（P < 0.01），抑制率约为0.70，而与X-tremeGENE/siRNA-EGFR组差异无统计学意义（P > 0.05）（图3）。

**P < 0.01

图3 Western blot检测四组C6细胞中EGFR蛋白的表达水平

2.4 C6细胞增殖的检测

TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组细胞的增殖速度比Control组及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组显著减慢（图4）。从第3天开始TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组与Control组及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组之间差异有统计学意义（P < 0.05），并随时间的延长差异增加（P < 0.01）。而TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组与X-tremeGene/siRNA-EGFR组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。

*P < 0.05，**P < 0.01

图4 CCK-8法检测四组C6细胞的增殖情况

2.5 C6细胞凋亡的检测

Control组、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组及X-tremeGene/siRNA-EGFR组细胞早期凋亡率分别为（1.61±0.25）、（1.84±0.30）、（9.81±0.47）及（10.40±0.40）（图5）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR组凋亡率较Control组及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr组明显增加（P < 0.01），而与X-tremeGene/siRNA-EGFR组差异无统计学意义（P > 0.05）。

3 讨论

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其预后较差，致残率及病死率都很高[19]。胶质瘤发生与发展伴有多种基因改变，因此基因治疗提供了一种新的治疗策略[20]。在此研究的基础上，本研究提出一种由TTA1-Tat-PEG-GS NPs结合siRNA与胶质瘤细胞mRNA相互作用的模式。这是一种将具有高特异靶向胶质瘤的TTA1及Tat多肽同时作为靶向基团，连接至GS NPs纳米材料上，并对其进行PEG修饰，设计成新型的TTA1-Tat-PEG-GS NPs基因载体。

為了研究新型基因载体TTA1-Tat-PEG-GS NPs结合siRNA是否能影响胶质瘤细胞的生长和生存，本研究利用TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR转染C6细胞后，通过Real-time PCR、Western blot分别在mRNA水平与蛋白水平检测了其对EGFR的干扰效果，随后通过CCK-8实验检测了细胞的增殖情况，并用流式细胞术检测了细胞的凋亡情况。结果显示：TTA1-Tat-PEG-GS NPs结合siRNA-EGFR转染C6细胞能够有效干扰ERGF的表达，EGFR表达下调后可明显降低C6细胞的增殖能力，并导致细胞凋亡率上升。

总之，本研究建立了一种新的基因载体TTA1-Tat-PEG-GS NPs，它具有体外转染细胞的能力，并具备靶向传递能力以及穿膜功能，这使TTA1-Tat-PEG-GS NPs有可能成为一种独特的基因传递载体，在胶质瘤的基因治疗中具有应用潜力。鲜见有文献报道以TTA1、Tat、PEG修饰的GS NPs作为基因传递系统在胶质瘤治疗的体内外实验中使用。然而，这种应用目前只用于体外胶质瘤细胞的siRNA传递，还没有用于体内胶质瘤动物模型。针对裸鼠原位胶质瘤模型的siRNA传递的更多研究是笔者正在起步的工作。

[参考文献]

[1] Dolecek TA，Propp JM，Stroup NE，et al. CBTRUS statistical report：primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009 [J]. Neuro Oncol，2012，14（5）：v1-v49.

[2] Stupp R，Mason WP，van den Bent MJ，et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma [J]. N Engl J Med，2005，352（10）：987-996.

[3] Chen JJ，Juan SY. Editorial（thematic issue：emerging concepts and therapeutics strategies for the treatment of brain tumors）[J]. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry，2014，14（8）：1063-1064.

[4] An S，Jiang XT，Shi JS，et al. Single-component self-assembled RNAi nanoparticles functionalized with tumor-targeting iNGR delivering abundant siRNA for efficient glioma therapy [J]. Biomaterials，2015，53：330-340.

[5] Stupp R，Hegi ME，Mason WP，et al. Effects of radiotherapy withconcomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase Ⅲ study：5-year analysis of the EORTC-NCIC trial [J]. Lancet Oncol，2009，10（5）：459-466.

[6] Wang SJ，Zhao Y，Ruan ZC，et al. Association between EGF +61 G/A and glioma risk in a Chinese population [J]. BMC Cancer，2010，10（1）：221.

[7] Kang CS，Zhang ZY，Jia ZF，et al. siRNA epidermal growth factor receptor silencing in U251 glioma cells [J]. Neural Regeneration Research，2008，（6）：652-655.

[8] Serguera C，Bemelmans AP. Gene therapy of the central nervous system：general considerations on viral vectors for gene transfer into the brain [J]. Revue Neurologique，2014， 170（12）：727-738.

[9] 李伟，刘佳，刘立.肿瘤基因治疗中腺病毒载体改造热点[J].中国生物化学与分子生物学报，2008，24（11）：1008-1013.

[10] Wen ZF，Jung F，Wang WW，et al. Genetic engineering of mesenchymal stem cells by non-viral gene delivery [J]. Clin Hemorheol Microcirc，2014，58（1）：19-48.

[11] Meade BR，Dowdy SF. Enhancing the cellular uptake of siRNA duplexes following noncovalent packaging with protein transduction domain peptides [J]. Adv Drug Deliv Rev，2007，60（4-5）：530-536.

[12] 朱文静，张学农.非病毒基因载体的递送屏障及其提高基因递送效率的研究进展[J].抗感染药学，2015，12（4）：487-493.

[13] Li SD，Huang L. Stealth nanoparticles：high density but sheddable PEG is a key for tumor targeting [J]. J Control Release，2010，145（3）：178-181.

[14] Essa S，Rabanel JM，Hildgen P. Characterization of rhodamine loaded PEG-g-PLA nanoparticles（NPs）：effect of poly（ethylene glycol）grafting density [J]. Int J Pharm，2011，411（1-2）：178-187.

[15] Hirata E，Arakawa Y，Shirahata M，et al. Endogenous tenascin-C enhances glioblastoma invasion with reactive change of surrounding brain tissue [J]. Cancer Sci，2009， 100（8）：1451-1459.

[16] Yao Q，Chen H，Yuan W，et al. Lipsome formulated with TAT-modified cholesterol for improving brain delivery and therapeutic efficacy on brain glioma [J]. Int J Pham，2011，420（2）：304-312.

[17] Wang ZY，Zhao Y，Ren L，et al. Novel gelatin-siloxane nanoparticles decorated by Tat peptide as vectors for gene therapy [J]. Nanotechnol，2008，19（44）：445103.

[18] 張龙，胡洋，林晓宁，等.Tat-TTA1-PEG共修饰明胶-硅氧烷纳米粒跨血脑屏障及对胶质瘤的靶向性研究[J].中国生化药物杂志，2014，（8）：43-46.

[19] Endersby R，Baker SJ. PTEN signaling in brain：neuropathology and tumorigenesis [J]. Oncogene，2008，27（41）：5416-5430.

[20] de Groot JF，Gilbert MR. New molecular targets in malignant gliomas [J]. Curr Opin Neurol，2007，20（6）：712-718.

（收稿日期：2015-11-14 本文编辑：张瑜杰）