丹参对子宫内膜异位症间质细胞MMP-9 mRNA及蛋白表达的影响

卢妙莲，李云，曾瑞丽，林海标，余冬青，张秀娟，曹楠楠，王建兵.广州中医药大学第二附属医院检验科，广东 广州 500 .广州中医药大学第二附属医院妇科，广东 广州 500 .广州中医药大学第二附属医院肝病科，广东 广州 500

丹参对子宫内膜异位症间质细胞MMP-9 mRNA及蛋白表达的影响

卢妙莲1，李云1，曾瑞丽1，林海标1，余冬青2，张秀娟3，曹楠楠1，王建兵1
1.广州中医药大学第二附属医院检验科，广东 广州 510120 2.广州中医药大学第二附属医院妇科，广东 广州 510120 3.广州中医药大学第二附属医院肝病科，广东 广州 510120

目的：观察丹参对子宫内膜异位症间质细胞基质金属蛋白酶9（MMP-9）mRNA和蛋白表达的影响，探讨其可能的机制。方法：用混合酶消化法进行间质细胞培养，分别加入空白对照（空白组），不同浓度丹参（1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L）（丹参1组、丹参2组、丹参3组、丹参4组）。细胞常规培养48 h后，用CCK-8法观察不同浓度的丹参对间质细胞增殖的影响，RT-PCR法检测其对MMP-9 mRNA表达的影响，Western blotting检测其对MMP-9蛋白含量的影响。结果：CCK-8法结果显示，除丹参1组外，其余丹参组间质细胞增殖与空白组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与空白组比较，除丹参1组外，各丹参组MMP-9mRNA表达降低、MMP-9蛋白表达量减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：丹参可以抑制异位内膜间质细胞增殖，同时可以抑制MMP-9mRNA和蛋白的表达，从而降低对细胞外基质的降解，最终抑制子宫异位内膜的种植、侵袭和转移。

子宫内膜异位症；丹参冻干粉；异位内膜间质细胞；基质金属蛋白酶9（MMP-9）

子宫内膜异位症（Endometriosis，EM）是妇科疑难病、多发病。子宫内膜细胞进行异位侵袭和种植过程中，必须降解该组织细胞外基质和基底膜，基质金属酶（matrix metalloproteinase，MMPs）家族中的MMP-9可能发挥重要作用［1］。现应用不同浓度丹参对EM在位内膜间质细胞中的MMP-9 mRNA及蛋白进行干预，探讨其可能的机制。

1　材料及方法

1.1试剂与药物高糖DMEM（Thermo公司）、胎牛血清（Hyclone公司）、Trizol（Invitrogen公司）、胰蛋白酶（Science公司）、逆转录试剂盒（Thermo公司）、PCR试剂盒（Tiangen公司）、二甲基亚砜（DMSO）、十二烷基硫酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）、甘氨酸（GLY）、MMP-9兔抗人多克隆抗体、β-actin兔多克隆抗体，以上试剂购自广州碧云天生物公司。丹参的冻干粉由广州中医药大学中心实验室制备加工后-20℃保存。

1.2仪器与设备CO2培养箱（Thermo公司）、Thermo MultiskanAscent酶标仪、96孔热循环仪（AB公司）、倒置相差显微镜（Nikon公司）、CP225D十万分之一分析天平（Sartorius公司）、紫外凝胶成像仪（Bio-Rad公司）、稳定电流电泳仪（北京六一仪器）。

1.3细胞培养与传代实验获得了广东省中医院医学伦理委员会的批准。15例异位内膜组织均来自2014年5月－2014年10月本院妇科行卵巢巧克力囊肿（增殖期）住院手术的患者。培养方法参照文献［2］。将子宫内膜组织剪成肉眼模糊状，加入胶原酶Ⅰ和胰蛋白酶的混合酶，消化后的细胞经38 μm（400目）筛网过滤后得到含间质细胞的滤液。将细胞接种于培养瓶中，24 h后将未贴壁细胞吸出，加入新的培养液，放入37℃、5%的CO2孵箱中培养。待细胞极尽铺满培养瓶后进行传代培养。传代次数越多，间质细胞纯度越高［3］。

1.4CCK-8实验取对数生长期间质细胞，制成单细胞悬液，接种于96孔培养板，置于细胞培养箱中培养24 h后，加入无血清的培养基继续孵育，使细胞处于G0期。每孔分别加入不同浓度的培养基100μL（空白组加入不含胎牛血清DMEM，丹参条件组加入终浓度为1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L4个组即丹参1组，丹参2组，丹参3组，丹参4组），每组各设3个复孔，培养48 h，每孔分别加入10 μL CCK-8液孵育1 h，用酶标仪在450 nm处测量吸光度值（OD值）。

1.5RT-PCR检测PCR扩增MMP-9基因，采用GAPDH作为内参照，引物序列如下：MMP-9上游引物5′-TCCCTG GAGACCTGAGAACC-3′，下游引物5′-GGCAAGTCTTCCG AGTAGTTT-3′，扩增产物 312bp；GAPDH上游引物 5′-GGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，下游引物5′-CACCATC TTCCAGGAGCGAG-3′，扩增产物352bp；反应条件为：94℃3 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，72℃延伸5 min，30个循环。用Quantity One凝胶图像分析系统分析灰度值，以各条带与GAPDH内参条带的比值，作为MMP-9 mRNA相对表达水平。

1.7Western blotting检测按试剂盒说明书提取总蛋白，按BCA法测量蛋白浓度。取30 μg蛋白样品，用SDS-PAGE聚丙烯凝胶电泳后进行转膜（PVDF膜），300 mA恒流转2 h，随后将PVDF膜置于含50g/L脱脂牛奶溶液中进行封闭，MMP-9和β-actin一抗分别用抗体稀释液稀释，膜置于一抗稀释液中，于4℃下平缓摇动过夜，二抗辣根过氧化物标记的IgG多克隆抗体按1∶5000稀释，膜在二抗稀释液中室温慢摇1 h，暗室内曝光检测。用Quantity One凝胶图像分析系统将每个条带灰度值数字化，目的蛋白的灰度值除以内参β-actin的灰度值以校正误差，所得结果代表目的蛋白的相对含量。

1.8统计学方法采用SPSS17.0软件进行数据分析，数据用（±s）表示。多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），将所有的条件组分别与指定的对照组进行比较。

2　结果

2.1间质细胞形态4 h后细胞基本全部贴壁，聚集成团并呈多角形；72 h后呈长梭形或纺锤形，交织成网；传代后的细胞生长较快，而且性状稳定，随着传代次数的增加，间质细胞的纯度也越高。

2.2各组间质细胞增殖、MMP-9mRNA及蛋白表达比较见表1、图1、图2。CCK-8法结果显示，除丹参1组外，其余丹参组间质细胞增殖与空白组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与空白组比较，除丹参1组外，各丹参组MMP-9 mRNA表达降低、MMP-9蛋白表达量减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1　各组间质细胞增殖、MMP-9mRNA及蛋白表达比较（±s）

表1　各组间质细胞增殖、MMP-9mRNA及蛋白表达比较（±s）

与空白组比较，①P＜0.05

组别空白组丹参1组丹参2组丹参3组丹参4组O D值0.754±0.029 0.738±0.021 0.669±0.036①0.456±0.034①0.358±0.028①M M P-9 mRN A 0.699±0.089 0.685±0.009 0.602±0.013①0.549±0.017①0.411±0.007①M M P-9蛋白0.819±0.010 0.798±0.039 0.705±0.119①0.646±0.388①0.549±0.214①

3　讨论

目前由于西药和手术给EM患者身心带来损伤，而采用中医治疗不仅能缓解这种状况，还能提高受孕率，具有复发率低等优点。中医学认为，瘀血内停是导致EM临床症状和体征的主要因素，故活血化瘀，行气止痛为其治疗大法［4］，并根据辨证辅以补肾健脾，疏肝行气，清热解毒化痰制品。丹参又名赤参，具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神等功效。

图1　不同条件组MMP-9 mRNA相对表达量

图2　不同条件组MMP-9蛋白相对表达量

EM在早期主要通过黏附性糖蛋白分子黏附于腹膜间皮表面，继而破坏细胞外基质，所以细胞外基质的降解是新生血管形成以及组织结构重建的基本条件［5］。有许多因子在细胞外基质降解过程中发挥重要作用，其中对MMPs家族研究较为广泛，MMP-9是MMPs家族中分子量最大的明胶酶。研究表明，异位内膜组织中MMP-9表达明显增强，提示其在EM的发生、发展中起到关键作用［6］。它几乎能降解细胞外基质中的所有成分，但主要降解细胞外基质中Ⅲ型/Ⅳ型胶原和明胶3种主要成分，并能促进心血管的生成，在子宫内膜细胞的黏附、侵袭和生长过程中发挥重要作用［7］。

本研究通过建立体外子宫异位症间质细胞培养体系，消除体内外各种影响因素，发现体外培养的子宫内膜间质细胞在给予1 mg/L药物后，作用不明显。给予5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L不同浓度药物刺激后，间质细胞的增殖受到影响（P＜0.05），丹参对异位间质细胞生长的抑制作用呈剂量依赖性，随着浓度增高而作用增强，表明丹参对异位内膜细胞增殖具有抑制作用；同时观察到，除1 mg/L组外，其它组MMP-9 mRNA和MMP-9蛋白表达水平与空白组具有显著差异（P＜ 0.05），子宫内膜间质细胞经丹参作用24 h后MMP-9 mRNA和蛋白表达量明显下调。所以丹参可以通过降低MMP-9的产生，从而降低对细胞外基质的破坏达到减轻临床症状的目的。但是中药是通过多种途径发挥作用，仅靠本实验还不能确定丹参具体能够影响到的细胞因子和酶，对此还有待深入系统的探讨和研究。

［1］王红静，黄倩，安寒，等.中草药治疗子宫内膜异位症的系统评价［J］.Chinese J Evidence-Based Medicine，2004，4（9）：602-608.

［2］ Brueggmann D，Templeman C，Starzinski-Powitz A，etal.Novel three-dimensional invitromodelsof ovarian endometriosis［J］.J Ovarian Res，2014，7：17.

［3］唐雪莲，谢梅青，张凤丽.高纯度分离子宫内膜腺上皮及间质细胞和体外培养技术［J］.中山大学学报，2003，24（6）：589-592.

［4］陈曜.扶正祛瘀法治疗子宫内膜异位症临床研究［J］.辽宁中医药大学学报，2012，12（10）：134-135.

［5］崔俊玉，杨尧华，张晟宁.Survivin和MMP-9在子宫内膜异位症中表达及相关性分析［J］.宁夏医科大学学报. 2011，33（8）：746-748.

［6］ Sharpe-Timms KL，Zimmer RL，Jolliliff WJ，et al. Gonadotropin-releasinghormoneagonist（GnRH-a）therapy alters activity of plasminogen activators，matrix metalloproteinases and their inhibitors in rat models for adhesionformationandendometriosis：potential GnRH-a-regulatedmechanismsreducingadhesion formation［J］.Fertility and Sterility，1998，69（5）：916-923.

［7］Giudice LC，Tazuke SI，Swiersz L.Status of current research on endometriosis［J］.J Reprod Med，1998，43：252-262.

（责任编辑：骆欢欢）

Effect of Salviae Miltiorrhizae on Stromal Cells MMP-9 mRNA and Protein Expression of Endometriosis

LU Miaolian，LI Yun，ZENG Ruili，LIN Haibiao，YU Dongqing，ZHANG Xiujuan，CAO Nannan，WANG Jianbing

Objective：To observe the effect of salviae miltiorrhizae on matrix metalloproteinase 9（MMP-9）mRNA and protein expression of endometriosis and discuss their feasible mechanism.Methods：Cultured stromal cells by the method of mixed enzymatic digestion，added respectively nothing（blank group）or different concentration of salviae miltiorrhizae（1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L）（salviae miltiorrhizae 1 group，salviae miltiorrhizae 2 group，salviae miltiorrhizae 3 group，salviae miltiorrhizae 4 group）.After cells were routine cultured for 48 h，observed the effect of different concentration of salviae miltiorrhizae on stromal cell proliferation by the method of CCK-8，and detected the effect on MMP-9 mRNA expression by the method of RT-PCR，then detected the effect on MMP-9 protein level by the method of Western blotting.Results：The result of CCK-8 showed that，differences of stromal cell proliferation between blank group and salviae miltiorrhizae groups other than salviae miltiorrhizae 1 group were statistical significant（P＜0.05）.Comparing with blank group，MMP-9mRNA expression was decreased and MMP-9 protein expression also was reduced in salviae miltiorrhizae groups other than salviae miltiorrhizae 1 group，differences being statistical significant（P＜0.05）.Conclusion：Salviae miltiorrhizae can inhibit ectopic stromal cell proliferation，meanwhile inhibit MMP-9mRNA and protein expression，consequently reduce degradation of extra cellular matrix，and ultimately inhibit cultivation，invasion and metastasis of uterus ectopic endometrium.

Endometriosis；Salviae miltiorrhizae freeze-dried powder；Ectopic stromal cell；Matrix metalloproteinase 9（MMP-9）

R711.71

A

0256-7415（2016）04-0278-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.04.105

2015-04-23

广东省中医药局课题（20132154）

卢妙莲（1979-），女，副主任技师，研究方向：临床检验标准化。