大血藤总黄酮分离纯化工艺研究

王建权，李奎永.慈溪市中医医院，浙江 慈溪 35300；.华东理工大学药学院，上海 0037

大血藤总黄酮分离纯化工艺研究

王建权1，李奎永2
1.慈溪市中医医院，浙江 慈溪 315300；2.华东理工大学药学院，上海 200237

目的：研究大孔吸附树脂分离纯化大血藤总黄酮的工艺条件。方法：以芦丁为对照品，考察大孔吸附树脂对大血藤总黄酮的富集纯化工艺。结果：采用DA201型大孔吸附树脂，上样吸附后，用纯化水和30%乙醇除杂，再用5BV、50%乙醇洗脱，可得到总黄酮含量为69.78%的大血藤提取物。结论：DA201型大孔吸附树脂在确定的工艺条件下，具有工艺简单、稳定、可靠的特点，能得到总黄酮纯度较高的大血藤提取物。

大血藤；总黄酮；大孔吸附树脂；分离纯化

大血藤亦被称为大活血、血藤等，为木通科植物大血藤的干燥根茎，多以茎入药，在我国南方地区分布广泛，具有活血化瘀、通经活络、祛风除湿、清热解毒等功效，临床上主要用于治疗跌打损伤、风湿痹痛、痛经、腹痛等。据文献报道，大血藤含有蒽醌类、黄酮类、皂苷类等成分［1］，现代药理学研究表明［2～3］，其含有的活性成分具有保护心肌、增加缺氧耐受力、抗菌消炎等作用，在临床应用较为广泛。大血藤总黄酮为其主要活性成分，目前尚未有文献报道其分离纯化工艺研究，笔者采用大孔吸附树脂分离纯化得到了总黄酮含量较高的大血藤提取物，可为工业化生产大血藤总黄酮提供参考。

1　材料与仪器

1.1材料芦丁对照品（中国食品药品检定所研究院，120716-201409）；HP20、HPD100、HPD600、HPD700、D101、DA201型大孔吸附树脂（均为沧州宝恩化工有限公司提供）；大血藤购自河北安国药材市场，经鉴定为木通科大血藤属植物藤茎；甲醇（色谱纯）（天津市恒兴化学试剂制造有限公司，20130320）；其余试剂均为分析纯。

1.2仪器Agilent 1200系列高效液相色谱仪（Agilent 1200色谱泵，ELSD-2000蒸发光散射检测器，Agilent 1200色谱工作站）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；KQ3200E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DFT-50手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；R-501型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）。

2　方法与结果

2.1方法

2.1.1大血藤总黄酮的提取取大血藤药材饮片，干燥、粉碎、过筛，取粉末约0.5 g，精密称定，置于具塞的锥形瓶中，加40 mL甲醇，超声提取60 min，放冷、静置、过滤。滤渣用少量甲醇洗入锥形瓶中，加适量甲醇（总体积约40 mL），超声提取60 min，放冷、静置、过滤。合并两次所得滤液，置于100 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，即得。

2.1.2大血藤总黄酮含量测定采用紫外-可见分光光度法，以芦丁为对照品，在360 nm处测定其吸光度值，以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y=0.2078X-0.2011，R2=0.9991，大血藤提取物照该方法稀释并测定，计算其总黄酮含量。

2.1.3上柱液的预处理称取大血藤药材饮片，加10倍量50%乙醇，于80℃加热回流提取2次，每次1 h，合并提取液，滤过、减压浓缩，配制成适用于树脂吸附的大血藤浸出液。

2.2工艺参数的考察与优化

2.2.1大孔吸附树脂的预处理分别称取HP20、HPD100、HPD600、HPD700、D101、DA201大孔吸附树脂适量，乙醇溶胀24 h后回流提取12 h，除去树脂中残留的致孔剂等杂质。湿法装柱，用95%乙醇洗涤树脂至流出液加等量水不呈现白色混浊为止。再用水洗至无醇味。改用5%盐酸溶液冲洗树脂，水洗至中性后换用2%氢氧化钠溶液洗涤，最后水洗至中性即可。

2.2.2大孔吸附树脂类型的选择取已处理好的树脂，置100 mL三角瓶中，加入30 mL固含量为12.14 mg·mL-1的预处理液。密塞，室温下以振荡频率200次/h振荡24 h。待充分吸附后，静置，倾出上清液，并加入适量蒸馏水洗涤树脂。洗涤液与上清液合并，另器储存。再加入100 mL95%乙醇在室温下洗脱。测定残留液和95%乙醇洗脱液中总黄酮含量，各种类型树脂对大血藤总黄酮的吸附量及解吸率结果见表1、表2。

按以下公式计算吸附率（%）、吸附量（mg/mL）以及解吸率（%）。吸附率（%）=（M0-C1V1）/M0×100%；吸附量（mg/mL）=（M0-C1V1）/V0；解吸率（%）=C2V2/（M0-C1V1）×100%。其中M0为初始加入的大血藤提取物的质量；V0为树脂的体积；C1为残留液中大血藤总黄酮的浓度；V1为残留液体积（100 mL）；C2为醇洗液中大血藤总黄酮的浓度；V2为醇洗液体积（100 mL）。

表1　不同类型树脂对大血藤总黄酮的吸附量　mg·mL-1

表2　不同类型树脂对大血藤总黄酮的解吸率　%

由表1、表2可知：DA201树脂对大血藤总黄酮的吸附量为最大，且解吸效果最好。故选用DA201树脂用于大血藤总黄酮的分离纯化。

2.2.3动态吸附条件的考察选取DA201树脂为模型，考察不同影响因素对大血藤总黄酮吸附效果的影响。经预处理过的树脂装入内径为1 cm的玻璃柱，上样，饱和吸附6 h后，开始洗脱。

2.2.3.1上样流速对吸附率的影响上样流速太快，大血藤总黄酮得不到充分吸附就随上样液流出；流速过慢虽可提高大血藤总黄酮的吸附率，但耗时较多。笔者考察了树脂柱床体积为5 mL，流速分别为0.5、1.0、1.5 mL·min-1时对吸附率的影响。结果显示：当流速为0.5 mL·min-1，上样体积为湿树脂柱床体积20倍时，大血藤总黄酮基本不泄漏，而流速为1.0 mL·min-1时泄露点出现较晚，可以通过反复上样的方法弥补。上样流速为1.5 mL·min-1时泄露点出现较早。为节约上样时间，选择流速1.0 mL·min-1为佳。

2.2.3.2吸附量与树脂量的关系见表3。本试验考察了吸附液浓度为245 mg·mL-1，大血藤提取物与大孔树脂用量的比值（m1∶m2）分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25时大血藤总黄酮的吸附率。

表3　不同的m1：m2的吸附率

由表3可知，当大血藤提取物与大孔树脂质量比为1∶20时较合适。虽然大血藤提取物与树脂之间质量比为1∶25时吸附效果更好，但这与大血藤提取物与树脂质量比为1∶20时相比较，差异无统计学意义（P＞0.05），故选取大血藤提取物与树脂之间质量比1∶20为最佳条件。

2.3洗脱剂浓度及用量的确定

2.3.1洗脱剂浓度的确定DA201树脂为非极性树脂，大血藤总黄酮为中等极性的物质，可先用纯化水除去水溶性杂质，再用不同浓度的乙醇为洗脱剂依次洗脱。乙醇的洗脱浓度梯度为：0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。结果显示，大血藤总黄酮主要富集于70%浓度的乙醇中。故应收集50%浓度的乙醇洗脱液。

2.3.2洗脱剂用量的考察经饱和吸附的树脂，先分别用纯化水和30%乙醇洗去部分杂质，均以洗脱液无色或接近无色为终点，然后更换下一个浓度梯度。收集50%乙醇洗脱液，每2.5 BV（柱床体积）收集一次，并进行检测。结果显示，当洗脱剂用量为5 BV时，大血藤总黄酮可基本洗脱完全。故选定洗脱剂用量为5 BV。

2.4验证实验为验证实验室小试所得到的工艺参数的稳定性，保证工业化生产的顺利进行，促进实验室研究成果的产业化转变。本试验在实验室研究的基础上对实验结果进行了3批中试分离纯化。对50%浓度乙醇洗脱液进行了含量测定，可得到总黄酮含量为69.78%（批次1、2、3纯度均数）的大血藤提取物。结果见表4。三批中试结果表明，所建立的DA201大孔吸附树脂法分离纯化大血藤总黄酮的方法稳定、可靠，适宜于大规模工业化生产。

表4　DA201大孔吸附树脂纯化大血藤总黄酮验证实验结果

3　讨论

大血藤总黄酮为大血藤中较重要的活性成分，近年来有关大血藤总黄酮报道的文献较多，如倪士峰等［4］研究表明，大血藤总黄酮具有清除氧自由基的作用，还可抑制细胞凋亡、抗肿瘤、防治心血管疾病；葛明菊等［5］采用聚酰胺薄层层析的方法对大血藤提取物进行分离，获得了10余种黄酮类成分，并采用高效液相色谱法对大血藤叶片、嫩茎、叶柄等药用部位中黄酮类成分进行分析，初步可知大血藤叶片及嫩茎中黄酮类化合物较多。尽管大血藤总黄酮的药理活性、化学成分分析较多，但大血藤总黄酮的分离纯化研究报道极少，因而研究大血藤总黄酮分离纯化工艺具有较大的应用价值，有可能为临床提供治疗疾病的有效部位［6］。

大孔吸附树脂的类型、用量等对活性成分的分离纯化有较大的影响，本研究前期通过静态吸附及动态解吸附实验，筛选得到了适合用于大血藤提取物中总黄酮富集的树脂类型，即中等极性的DA201树脂，同时对树脂的用量与分离纯化效果的相关性进行了考察，结果显示，树脂的用量越大，越有利于其吸附总黄酮，即吸附率越高，但实际应用过程中需充分考虑分离纯化工艺的经济性、可行性、高效性等，因树脂用量过大会消耗过多的洗脱溶剂，部分杂质亦会进入洗脱液，导致大血藤总黄酮含量降低，间接降低了树脂的分离纯化效果［7］，故本研究综合各方面影响大血藤总黄酮纯度的因素及工业化生产的效率，筛选最适宜的树脂和大血藤提取物的比例，以便提高工业化生产大血藤总黄酮的效率。

本研究最终确定了大血藤总黄酮的分离纯化条件为：大血藤提取物经初步后，用已处理好的DA201型大孔吸附树脂将大血藤提取物进行吸附，待吸附完成后，先用纯化水及30%乙醇除杂，再用5BV、50%乙醇洗脱，收集洗脱液，过滤并浓缩干燥即得大血藤总黄酮。为保证工艺的可行性，在实验室研究的基础上进行了三批中试试验，结果显示该分离纯化工艺具有工艺稳定、可靠，适宜于大规模工业化生产的特点，为工业化生产大血藤总黄酮提供了参考。

［1］马瑞丽，于小凤，徐秀泉，等.大血藤的化学成分及药理作用研究进展［J］.中国野生植物资源，2012，31（6）：1-5.

［2］丁越，张永，丁文平，等.HPLC测定大血藤药材中绿原酸的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（4）：99-102.

［3］刘宇文，殷红妹，邹耀华.HPLC同时测定大血藤中红景天苷和绿原酸的含量［J］.中国现代应用药学，2012，29（10）：947-949.

［4］倪士峰，傅承新，吴平.大血藤化学成分及药学研究进展［J］.中国野生植物资源，2004，23（4）：8-10.

［5］葛明菊，金则新，李钧敏，等.大血藤黄酮类化合物组成的初步研究［J］.山西医科大学学报，2002，19（4）：382-386.

［6］卫建琮，李华峰，乔华，等.中药蒲公英花中总黄酮的分离纯化研究［J］.中国药物与临床，2014，14（1）：19-21.

［7］赵惠茹，马姣姣，魏彩霞，等.大孔吸附树脂分离纯化蒲公英中总黄酮的工艺研究［J］.中国药业，2014，23（12）：81-83.

（责任编辑：刘淑婷）

R284.2

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0256-7415（2016）04-0275-02

10.13457/j.cnki.jncm.2016.04.104

2015-12-19

王建权（1979-），男，主管中药师，主要从事中药研究工作。