黄精发酵工艺的初步研究

杨婧娟，张希，谭书宇，赵声兰

（云南中医学院，云南昆明650500）

黄精发酵工艺的初步研究

杨婧娟，张希，谭书宇，赵声兰*

（云南中医学院，云南昆明650500）

研究制备黄精酵素的发酵工艺。以淀粉酶活力、SOD酶活力、多糖及皂苷含量为指标，在单因素试验基础上采用响应面Box-Benhnken试验设计优化微生物发酵过程。最终确定较优工艺为：糖添加量40%，料水比1∶10（g/mL），酵母菌接种量2.4%，静置发酵3 d。以此为基础，得到黄精酵素产品淀粉酶活力347.33 U/g，SOD酶活力131.95 U/g，多糖含量469.84 mg/g，皂苷含量1.39 mg/g，经发酵的酵素产品具有清香味，去除了生黄精的麻味和刺激性，适口性得以提高，可制备良好的黄精酵素食品。

黄精；发酵；酵素；酶活；多糖；皂苷

黄精为百合科黄精属多年生草本植物，具有补气养阴，健脾、润肺、补肾等功效，是我国传统药食两用资源。现代药理学研究发现，黄精含有黄精多糖、甾体皂苷、黄酮、生物碱、氨基酸等成分，有抗衰老、抗肿瘤、抗炎、提高免疫及调节血糖血脂等功效，具有较高的开发与应用价值［1］。然而，生黄精具有麻味、刺激咽喉，不宜生品服用［2］，使黄精的食疗价值未能在日常生活中得到推广应用。本研究应用微生物发酵技术发酵黄精，通过微生物发酵代谢可产生各种外源活性酶［3］（如SOD酶）或有益次级代谢产物，发酵过程中复合酶的破壁作用也有利于黄精中活性成分（如多糖、皂苷）溶出。通过补充这些外源活性物质，可以弥补现代食品加工方式及人类饮食结构改变引起的机体酶失衡及营养不均衡，促进机体正常新陈代谢、提高免疫等［4-5］。此外，通过发酵处理还可去除生黄精的刺激性成分，提高适口性，有利于黄精功能性食品的研究开发。

1　材料与方法

1.1试验材料

原料：滇黄精的干燥根茎，购自云南绿生药业有限公司。

试验菌种：啤酒酵母，云南中医学院食品微生物实验室菌种。

1.2试验方法

1.2.1黄精酵素制备工艺流程

取一定量黄精→清洗干净→蒸馏水浸泡3 h→沥干→用糖水打浆（调节糖水浓度及制浆料液比）→匀浆液→121℃灭菌20 min→接种酵母菌种→混匀→32℃静置发酵→离心过滤→上清为黄精酵素液

1.2.2黄精酵素品质指标测定

淀粉酶活的测定［6］：按3，5-二硝基水杨酸法操作，以麦芽糖为标准品，在波长540 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线：Y=1.197x-0.029 7，R2=0.999。取稀释至一定倍数的供试样液与1%淀粉溶液反应，反应液按标准物质测定方法操作。其中，1 mL（g）酶在40℃条件下1 min水解1%淀粉产生1 mg麦芽糖所需酶量定义为1个酶活力单位（U）。

SOD酶活的测定［7-8］：按邻苯三酚自氧化法操作。在一定条件下，1 mL反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位。

多糖含量的测定［9］：按苯酚硫酸法操作。以葡萄糖为标准品，于波长490 nm处测定吸光度，绘制标准曲线（Y=20.214 x-0.011 3，R2=0.998）。取一定量黄精酵素液，加入无水乙醇使含醇量达80%，静置过夜，抽滤后弃上清液，残渣用80%乙醇洗涤3次，低温烘干，残渣用蒸馏水溶解并定容至250 mL，得样品供试液备用。取样品供试液同标准物质测定方法操作，计算酵素样中多糖含量。

皂苷含量的测定［10］：按香草醛高氯酸比色法操作，以人参皂苷Rb1为标准品，在波长545 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线（Y=33.947x-0.012 5，R2=0.997 3）。取一定量黄精酵素液，按1∶1的体积比用水饱和正丁醇萃取3次，取正丁醇相收集浓缩后得总皂苷粗提物，用热蒸馏水溶解并定容至100 mL，得样品供试液备用。取样品供试液同标准物质测定方法操作，计算酵素中总皂苷含量。

1.2.3试验设计

1.2.3.1单因素试验

为得到较优黄精酵素发酵工艺，在其他条件保持不变时，分别考察不同发酵条件：发酵时间（1、2、4、6、8、10 d）、接种量（0.25%、0.5%、1%、2%、4%、8%）、基质中加糖量（5%、10%、15%、20%、30%、40%）、料水比［1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10（g/mL）］对酵素制备工艺的影响。以淀粉酶活力、SOD酶活力、多糖含量、皂苷含量为指标，采用综合评分法进行数据分析。其中，酵素综合品质应优先考虑酶活力，使酶活力达到最佳水平的基础上，尽可能的在发酵过程中保留（或获得）活性物质，使其含量达到较高水平。基于此目标对各指标进行权重系数确定，淀粉酶活力、SOD酶活力权重系数分别为0.4；多糖含量及皂苷含量权重系数分别为0.1。运用隶属度综合评分法［11］和赋予的权重进行加权求和即可得到各指标的综合评分。其中隶属度按下式计算：

式中：Ci为指标值；Cmin为指标最小值；Cmax为指标最大值。

1.2.3.2响应面法优化黄精酵素发酵工艺

根据单因素试验结果，以酵素的淀粉酶、SOD酶活力及多糖、皂苷含量4个指标为响应值，选取发酵时间、接种量、基质中加糖量及料水比作为响应面优化的因素进行Box-Benhnken设计，并应用Design Expert软件对试验数据进行回归分析得出黄精酵素制备的最佳发酵工艺条件［12-13］。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

不同发酵时间对各指标的影响见图1。

图1　发酵时间对各指标的影响Fig.1Effect of fermentation time on different index

图1结果显示随着发酵时间的延长，当发酵到第4天时黄精酵素的综合评分最高，酶活及活性成分的含量均呈现较高水平，发酵时间超过4 d，微生物代谢活动逐渐减慢，综合评分呈下降趋势，SOD酶活不断减弱，且随着发酵时间延长，基质中营养成分被消耗而不足以满足过多菌体所需，微生物会分解皂苷、多糖等成分以维持自身生长所用，导致其含量降低。

不同接种量对各指标的影响见图2。

图2中显示从接种量0.5%开始，随着接种量增加黄精酵素的综合评分不断上升，达到4%时评分最高，之后开始降低。SOD酶、淀粉酶活及皂苷含量在接种量为2%～8%范围内均稳定维持在相对较高水平，而接种过量除了菌体竞争营养物质造成供给不足，过量生长的菌体产生的各种代谢产物也会影响菌体正常生长，造成产酶活减弱等［14］。

不同糖添加量对各指标的影响见图3。

图2　接种量对各指标的影响Fig.2Effect of inoculum concentation on different index

图3　糖添加量对各指标的影响Fig.3Effect of addition level of sugar on different index

图3中显示随着基质中糖添加量的增加，黄精酵素的各项指标及综合评分不断上升，但为了维持基质中适宜的渗透压，并防止可直接利用营养过剩造成菌体提前进入衰亡期，糖添加量控制在30%～40%范围内。

不同料水比对各指标的影响见图4。

图4　料水比对各指标的影响Fig.4Effect of ratio of material to water on different index

图4中显示随着料水比增加，黄精酵素的综合评分不断上升，在料水比1∶6（g/mL）～1∶10（g/mL）时达到较高值并维持相对稳定水平。调节基质中适宜的含水量有利于菌体对营养物质的吸收，可维持培养基适宜的疏松度避免干化或黏粘，并防止含水过多造成菌体缺氧等。综上所述，分别选取发酵时间3、4、5 d；接种量2%、4%、6%；加糖量30%、35%、40%；料水比1∶6、1∶8、1∶10（g/mL）水平进行响应面设计。

2.2响应面优化试验结果与分析

2.2.1响应面分析因素的选取及回归模型建立与分析［15-16］

在单因素试验基础上，对发酵时间、接种量、基质中加糖量及料水比4个因素进行Box-Benhnken设计，设计24个析因点，重复5次零点试验以估计误差。设计方案及响应值结果见表1、表2。

表1　试验设计因素和水平Table 1Factors and Levels

表2　黄精发酵的Box-Behnken试验设计及结果Table 2Design and results of fermentation for Rhizoma polygonati

续表2黄精发酵的Box-Behnken试验设计及结果Continue table 2Design and results of fermentation for Rhizoma polygonati

表3　以淀粉酶活性为响应值的自变量方差分析Table 3Variance analysis for the developed quadratic regression model of amylase activity

表4　以SOD酶活性为响应值的自变量方差分析Table 4Variance analysis for the developed quadratic regression model of SOD activity

续表4以SOD酶活性为响应值的自变量方差分析Continue table 4Variance analysis for the developed quadratic regression model of SOD activity

表5　以多糖含量为响应值的自变量方差分析Table 5Variance analysis for the developed quadratic regression model of polysaccharide content

表6　以皂苷含量为响应值的自变量方差分析Table 6Variance analysis for the developed quadratic regression model of saponin content

分别以淀粉酶活性、SOD酶活力活性、多糖含量、皂苷含量作为响应值，应用Design Expert软件对表2试验数据进行回归分析，分别建立了淀粉酶活性（Y淀粉酶活性）、SOD酶活力活性（YSOD酶活性）、多糖含量（Y多糖含量）、皂苷含量（Y皂苷含量）4个指标的回归模型，各回归模型方程如下：

以淀粉酶活力为指标的二次回归模型P值为＜0.000 1＜0.01，表明模型达极显著水平，以SOD酶活力、多糖含量、皂苷含量为指标的模型P值分别为0.0486、0.0214、0.039，均小于0.05，表明模型显著。淀粉酶活力、SOD酶活力、多糖含量、皂苷含量4项指标的判断系数（R2）分别为0.936 7、0.921 4、0.908 3、0.926 5，说明试验结果与模型拟合程度良好。

对各自变量进行方差分析以进一步对回归系数做显著性检验，表3～表6结果显示：各因素影响淀粉酶活性的主次顺序为：料水比＞加糖量＞发酵时间＞接种量，其中基质加糖量（C）和料水比（D）对酵素淀粉酶活力影响达极显著水平（P＜0.01）；各因素影响SOD活性的主次顺序为：发酵时间＞加糖量＞料水比＞接种量；各因素影响多糖含量的主次顺序为：加糖量＞接种量＞料水比＞发酵时间，其中基质中加糖量（C）对酵素中多糖含量影响达显著水平（P＜0.05）；各因素影皂苷含量的主次顺序为：料水比＞发酵时间＞加糖量＞接种量。

2.2.2因素交互作用分析

表3方差分析结果显示，以淀粉酶为响应值时交互作用项CD的P值＜0.01，影响极显著，该两个因素交互作用的响应面和等高线图见图5。

由图5可知，在基质加糖量范围内，随着料液比的增加，淀粉酶活力不断增大。基质中的加糖量与料水比两个因素共同影响了培养基中的渗透压，糖溶液浓度越高，渗透压越大，过高的渗透压可能会造成微生物失水死亡，不利于菌体生长，影响产酶。试验结果显示，在加糖量30%～40%范围内，料液比增大至1∶10（g/mL）水平时基质中糖浓度稀释到适宜菌体生长的良好环境，有利于其代谢产酶，显示出较高的酶活力。

图5　加糖量和料水比的交互作用对淀粉酶活性的影响Fig.5Response surface and contour plot for the interactive effects of addition level of sugar and ratio of material to water on amylase activity

表4分析结果可知，以SOD酶为响应值时交互作用项AC的P值为0.024＜0.05，影响显著，该两个因素交互作用的响应面和等高线图见图6。

由图6可知，当发酵时间小于4.5 d，随着基质中糖添加量的增加，SOD酶活性逐渐上升，当发酵时间大于4.5 d时，酶活性反而出现随糖添加量的增加而降低的趋势。基质中糖添加量越多，菌体可直接利用的营养越多，会迅速生长繁殖，代谢活动加强，有利于其产酶，呈现酶活力增强，但如果发酵时间延长，菌体长期处于旺盛生长状态会提前进入衰亡期，使产酶能力减弱，因此，应协调糖添加量与发酵时间的关系，如果糖加量多，应缩短发酵时间以利于菌体适度生长。

图6　发酵时间和加糖量的交互作用对SOD酶活性的影响Fig.6Response surface and contour plot for the interactive effects of time and addition level of sugar on SOD activity

表5方差分析结果显示，基质中加糖量和接种量对多糖含量的影响程度最大，图7为固定发酵时间和料水比，BC两自变量对多糖含量的交互效应。

图7　加糖量和接种量的交互作用对多糖含量的影响Fig.7Response surface and contour plot for the interactive effects of addition level of sugar and inoculation amount on polysaccharide content

由图7可知，在基质加糖量范围内，随着接种量的增加，多糖含量不断降低。接种量的增加带来基质中菌体密度增高，使得基质中有限的营养物质逐渐被消耗，微生物先分解易吸收利用的小分子糖等，直至供给不足会分解多糖等物质供生长代谢活动所用，造成其含量下降，而且过量繁殖的菌体在发酵过程中产生的部分物质会改变基质内环境，干扰菌体代谢活动，影响酵母多糖等代谢产物的生成。

以皂苷含量为响应值时交互作用项CD的P值为0.035 4＜0.05，影响显著，该两个因素交互作用的响应面和等高线图见图8。

图8　加糖量和料水比的交互作用对皂苷含量的影响Fig.8Response surface and contour plot for the interactive effects of addition level of sugar and ratio of material to water on saponin content

由图8可知，当基质中糖添加量小于37.5%时，随着料水比增加，皂苷含量逐渐增加，当糖添加量超过37.5%时，随着料水比增加，皂苷含量有所下降。基质中的加糖量与料水比（加液量）两个因素共同影响培养基中的渗透压，当两者比例适当构成了适宜菌体生长的外环境，溶解在水中的糖作为可直接利用的正营养因子会促进菌体生长，尤其是含量越高，营养越丰富，菌体生长繁殖越迅速，但是过度繁殖，当营养不足以满足过高的菌浓度时，菌体会将皂苷等成分当做营养物质分解，造成其含量下降。

2.2.3黄精发酵最优工艺参数的确定

工艺优化以淀粉酶活力、SOD酶活力及多糖含量和皂苷含量4项指标的综合评分为最终的响应值，运用隶属度综合评分法和赋予的权重进行加权求和得到各指标的综合评分结果见表7。

表7　各指标综合评分Table 7Comprehensive score value of different index

表8　模型回归系数显著性检验结果Table 8Significance of coefficients of quadratic regression model

利用Design Expert软件对综合评分结果进行二次多项回归拟合，得到各因素对产品综合评分的回归方程：

该模型P值0.001 6＜0.01，表示试验模型极显著。模型的决定系数R2=0.944，说明此模型拟合程度良好，可用此模型对黄精酵素发酵工艺进行分析和预测。表8模型回归系数显著性检验结果显示，各因素影响酵素综合评分的主次顺序为料水比＞加糖量＞发酵时间＞接种量，其中因素C和D的P值＜0.01，表明加糖量和料水比对酵素综合评分的影响达极显著水平，因素A的P值＜0.05，说明发酵时间对黄精酵素综合评分影响显著。

应用Design-Expert软件对试验模型进行分析，得到黄精发酵的最佳工艺条件：发酵时间3 d，接种量2.4%，基质中加糖量为40%，料水比1∶10（g/mL），在此点预测所得黄精酵素的综合评分为0.933 7，重复3次进行验证试验，发酵黄精得到黄精酵素各项指标的平均值为淀粉酶347.33 U/g，SOD酶131.946 7 U/g，多糖含量469.84 mg/g，皂苷含量1.39 mg/g，其综合评分为0.909 9，与预测值基本接近，说明响应面优化工艺有效。

3　结论

黄精发酵过程中基质糖添加量、料水比及发酵时间3个因素对酵素综合品质指标均有显著影响，通过综合指标优化，确定最佳发酵工艺参数为糖添加量40%，料水比1∶10（g/mL），接种量2.4%，发酵时间3 d。以此工艺条件为基础，得到黄精酵素食品淀粉酶活力347.33 U/g，SOD活力131.95 U/g，多糖含量469.84 mg/g，皂苷含量1.39 mg/g，其综合评分为0.909 9，与预测值基本接近，说明响应面优化工艺有效。发酵后所得酵素食品具有清香味，去除了生黄精麻味和刺激性，为以黄精为主的功能性食品开发奠定一定基础。

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A Preliminary Research of Fermentation Conditions of Rhizoma polygonati

YANG Jing-juan，ZHANG Xi，TAN Shu-yu，ZHAO Sheng-lan*
（Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，Yunnan，China）

The fermentation conditions were investigated in the preparation of Rhizoma polygonati ferment.The amylase activity，SOD activity，polysaccharide and saponin content were taken as index，the single factor experiment and response surface Box-Benhnken design were employed to optimize the fermentation conditions by yeast.At the optimum fermentation conditions，40%sugar addition level in the medium，1∶10（g/mL）of the materials/water ratio at inoculation amount 2.4%for 3 days，the ferment production amylase activity was 347.33 U/g，SOD activity was 131.95 U/g，polysaccharide content was 469.84 mg/g，saponin content was 1.39 mg/g，and the production was faint scent as the irritation of crude Rhizoma polygonati was removed.It was indicated that fermentation was a feasible approach for the preparation of Rhizoma polygonati ferment food.

Rhizoma polygonati；fermentation；ferment；enzyme activity；polysaccharide；saponin

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.020

2015-10-16

云南中医学院大学生创新训练计划项目（30270101600）；云南省应用基础研究计划项目青年项目（2016FD054）

杨婧娟（1986—），女（白），助教，硕士，研究方向：天然产物研究与开发。