液体食品包装用塑料复合膜、袋微生物检验方法的研究

北京市射线应用研究中心（101113）李娜 陈坚 燕瑾 郝松松

近年来，食品安全事件频发，其中微生物超标造成人身伤害在其中占很大比例，在排除产品自身因素影响之外，包装材料对于产品的影响是最直接的。现行国家标准GB19741：2005针对《液体食品包装用塑料复合膜、袋》类产品日常微生物检验引用国家标准GB/T4789.2菌落总数测定方法。但在微生物日常检测中发现，此方法对于液体食品包装用塑料复合袋适用性并不强。

本研究选取了三种不同的微生物检验方法，对同一厂家生产的不同规格的液体食品包装用塑料复合袋进行为期1年的生物负载量的对比实验，同时每种方法选取两种洗脱液进行微生物洗脱。

通过检测，发现灌装薄膜过滤法相较于棉拭子涂抹及稀释直接倾注法更能有效地将液体食品包装用塑料复合袋上的微生物洗脱下来，降低了微生物负载的检出限，提高了检出率。洗脱液的不同种类，对检出结果未有显著差异。一年四季不同的温、湿度生产条件下生产的产品，产品生物负载未显现季节性差异。

1 实验材料和实验方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品 某一生产厂家液体食品包装用塑料复合袋：8L、20L、50L、220L四种规格。

1.1.2 仪器 ①冰箱（0℃～4℃）：海尔电器提供。②恒温培养箱（32℃、24℃）：上海一恒科学仪器有限公司提供。③电子天平：0g～1000g，精确至0.1g。上海精密科学仪器有限公司提供。④座式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械生产厂提供。⑤电热鼓风干燥箱（10℃～250℃）：上海一恒科学仪器有限公司提供。

1.1.3 试剂 ①平板计数培养基：北京陆桥技术有限责任公司提供。②PH7.0灭菌氯化钠蛋白胨缓冲溶液：北京陆桥技术有限责任公司提供。③灭菌蒸馏水。④大肠埃希菌 CMCC（B）44 102：杭州微球生物技术有限公司提供。⑤金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26 003：杭州微球生物技术有限公司提供。⑥枯草芽孢杆菌：CMCC（B）63 501：杭州微球生物技术有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 方法一：GB/T4789.2食品微生物学检验 菌落总数测定。

1.2.1.1 剪取液体食品包装用塑料复合袋内双层透明膜25g分别置盛有225ml生理盐水及氯化钠蛋白胨缓冲溶液的无菌三角瓶内，置于摇床震荡30分钟，制成1：10的样品匀液。

1.2.1.2 选择1∶10、1∶100、及1∶1000比例稀释液，吸取1ml至平皿中，及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。35℃培养2～4天，每天观察。

1.2.2 方法二：2010版《中华人民共和国药典》附录Ⅻ G微生物限度检查法（薄膜过滤法）。

1.2.2.1 以无菌操作，分别将150ml、250ml、450ml、950ml灭菌生理盐水及灭菌氯化钠蛋白胨缓冲溶液，从袋口处加入到8L、20L、50L、220L不同规格液体食品包装用塑料复合袋内，震荡30分钟备用。

1.2.2.2 以无菌操作，用灭菌孔径0.45μm，直径50mm的微孔滤膜过滤浸泡实验样品的缓冲液，并用灭菌蛋白胨缓冲溶液冲洗滤膜，将滤膜放到平板计数琼脂培养基上进行培养。35℃培养2～4天，每天观察。

1.2.3 方法三：棉拭子擦拭法（10cm×10cm）。

1.2.3.1 以无菌操作，剪开液体食品包装用塑料复合袋，将灭菌10cm×10cm规格板贴在最内层膜上，在框内用灭菌棉拭子擦拭，装入100ml灭菌生理盐水及灭菌氯化钠蛋白胨缓冲溶液中，震荡混匀。

1.2.3.2 以无菌操作，用灭菌孔径0.45微米，直径50毫米的微孔滤膜过滤浸泡棉拭子的缓冲液，并用灭菌蛋白胨缓冲溶液冲洗滤膜，将滤膜放到平板计数琼脂培养基上进行培养。35℃培养2～4天，每天观察。

附表1 四种规格液体食品包装用塑料复合袋用三种方法，两种不同的洗脱液进行微生物洗脱，在1、2季度培养结果。

附表2 四种规格液体食品包装用塑料复合袋用三种方法，两种不同的洗脱液进行微生物洗脱，在3、4季度培养结果。

附表3 同种规格体食品包装用塑料复合袋包装不同产品反复洗脱后菌落总数结果

1.2.4 反复洗脱实验

1.2.4.1 取5件220L液体食品包装用塑料复合袋，分别以无菌操作，从注水口分别将定量菌株（50～100cfu）加入液体食品包装用塑料复合袋内，干燥。

1.2.4.2 以无菌操作，将950ml灭菌生理盐水从注水口分别加入液体食品包装用塑料复合袋中，充分震荡浸泡产品30分钟后，用灭菌孔径0.45微米，直径50毫米的微孔滤膜过滤浸泡实验样品的缓冲液，并用灭菌蛋白胨缓冲溶液冲洗滤膜，将滤膜放到平板计数培养基上进行培养。35℃培养2～4天，每天观察。

1.2.4.3 将这5件产品反复以1.2.4.1的方法操作五次。

2 实验结果

液体食品包装用塑料复合袋4种规格：8L、20L、50L、220L，按月份，分季度用三种方法，两种不同的洗脱液进行微生物洗脱并培养，结果如下。第一、二季度结果（见附表1）。第三、四季度结果（见附表2）。

2.1 结果分析 一年当中的四季，在不同温、湿度环境下生产的液体食品包装用塑料复合袋，微生物检验三种方法中，方法一使用GB/T4789.2中稀释直接倾注法，其结果大都处于下限即＜10cfu/g，全年只有两次的菌落总数结果为10cfu/g；方法二使用《中华人民共和国药典》中提到的薄膜过滤操作方法，结果从＜1cfu/件到196cfu/件不等；方法三使用GB/T19973.1中提到的棉拭子擦拭的方法，所出结果大都为＜1cfu/100cm2，全年只有一次的菌落总数结果为1cfu/100cm2。三种方法中，每月同样检测方法对比发现，结果差异性不大。

2.2 反复洗脱结果（方法二），见附表3。

2.2.1 结果分析 通过反复洗脱实验结果表明，校正因子为1.32，平均回收率为75.52%，大于50%，符合标准要求。由此证明薄膜过滤方法适用于液体食品包装用塑料复合袋的微生物洗脱。实际检出率进一步提高。

3 结果讨论

3.1 对于结果数据的讨论

3.1.1 历时一年的检测，对于上述三种不同的微生物检验方法，其中方法一：GB/T4789.2是标准GB19741-2005液体食品包装用塑料复合袋对于微生物检验要求的规定方法，其中要求检验“与食品接触表面的菌落总数”，实际称取的样品包含与食品接触表面和与非食品接触表面，检验结果并非与食品接触表面的菌落总数，而是与食品接触表面和与非食品接触表面两面的菌落总数，故与GB19741-2005提出的标准要求不相符。由于所剪面积有限，对于规格较大的液体食品包装用塑料复合袋的代表性并不充分，以及其稀释的方法，所有检出下限的报告值均为＜10cfu/g，如果样品中菌落总数含量在10cfu以下，或者是由于微生物分布不均，所剪部分恰巧没有微生物存在，都会导致结果不能真实反映产品本身微生物含量。

3.1.2 方法二：《中华人民共和国药典》中以及GB19973.1中提到对于样品的处理可以使用薄膜过滤方法，虽然此方法大部分应用于药品以及医疗用品，但在长期的工作积累下发现此方法同样适用于液体食品包装用塑料复合袋以及其它封闭类的食品包装袋，通过注水口注入洗脱液，封闭注水口反复震荡洗脱30分钟，使洗脱液充分接触液体食品包装用塑料复合袋与食品接触面，所洗脱下的微生物系整件产品的菌落总数，相较于“个/cm2”更有说服力。

3.1.3 方法三：GB19973.1中提到对于样品的处理可以使用棉拭子擦拭的方法，通过使用10cm×10cm规格板贴在与食品接触面上，在框内用灭菌棉拭子擦拭，其报告结果虽然符合GB19741-2005中报告的要求，但是由于擦拭面积小，对于规格较大的液体食品包装用塑料复合袋代表性不强，或者是由于微生物分布不均，所擦拭部分恰巧没有微生物存在，都会导致结果不能真实反映产品本身微生物含量，以及有些收集到的微生物可能会被拭子本身组织所吸附从而不会检测到，所以此方法不能真实的反映出产品上的微生物含量。

3.1.4 在标准GB19741-2005中要求最终细菌报告的单位为“个/cm2，是不符合的。世界卫生组织和新的微生物检验国家及国际标准中均建议使用“cfu”代表菌落而不是“个”。建议在GB19741—2005标准修订时加以修改。

3.1.5 在使用不同方法对液体食品包装用塑料复合袋微生物洗脱过程中，使用两种不同的洗脱液，发现其结果差异性不大，故此类产品的微生物检验洗脱液种类对其的影响可以排除。

3.1.6 历时一年的检测中，菌落总数检出量不因温度的高低变化发生显著地变化，故此可以排除温度此类产品微生物洗脱的影响。

4 结论

本课题对于液体食品包装用塑料复合袋微生物检验，通过对四种不同规格，两种不同的洗脱液，三种不同的洗脱方法，历时一年的监测，得出：首先，液体食品包装用塑料复合袋在温、湿度不同的各个季节，其菌落总数测量结果不会发生显著地变化；其次，液体食品包装用塑料复合袋的菌落总数测量结果不受洗脱液种类影响；第三，采取方法二（灌装后薄膜过滤法）更能有效地将液体食品包装用塑料复合袋与食品接触面上的微生物洗脱下来，由于其检出限低，检出率高，其结果能更真实的反映出产品上微生物的含量。

在标准GB19741-2005中菌落总数测定规定的方法相较处于劣势，且在标准GB19741-2005中要求最终细菌报告的单位为“个/cm2，与世界卫生组织和新的微生物检验国家及国际标准中均建议使用“cfu”代表菌落而不是“个”， 是不符合的。建议在GB19741—2005标准修订时参考以上结论。