甲硝唑-β-环糊精包合物制备工艺优化与质量评价

潘如金

(江苏省中医院　药学部，江苏　南京　210029)



甲硝唑-β-环糊精包合物制备工艺优化与质量评价

潘如金

(江苏省中医院药学部，江苏南京210029)

目的：优化甲硝唑-β-环糊精包合物的制备工艺，并探索其对提高甲硝唑水溶性、化学稳定性等方面的影响。方法：用饱和水溶液法制备包合物，以包合物的包合率作为评价指标，采用响应面设计法对其包合工艺进行优化以确定最佳制备工艺。结果：最佳制备工艺为：包合温度49 ℃，包合时间1.85 h，β-环糊精-甲硝唑摩尔比1.4 ∶1，包合物的包合率为72.54%。结论：通过响应面法优化制得的甲硝唑-β-环糊精包合物，物理化学性质较为稳定，能够明显提高甲硝唑的水溶性，选用的模型合理有效。

甲硝唑；响应面法；β-环糊精；包合物；质量评价

甲硝唑(Metronidazole，MNZ)是一种硝基咪唑类药物，对于滴虫和阿米巴病有显著的治疗作用，对厌氧菌具有确切的抑制效果已被最近几年的研究证实，而且在内科，外科和口腔科的应用也非常广泛[1]，而由于水溶性较低，稳定性差等因素使得甲硝唑在制剂生产与临床应用等过程产生了多方面的限制[2-3]。β-环糊精(β-Cyclodextrin, β-CD)拥有特殊的空腔分子结构，其分子外部可亲水而内部疏水，在范德华力作用下能够把一些不具有生物相容性的药物分子包合于其分子空腔中，从而形成类分子胶囊样的包合物[4]，既可增加药物的生物相容性，又能起到缓释作用。将甲硝唑包合于其分子的空腔结构中有助于提高其水溶性并改善稳定性。

响应面法是是数学方法与统计方法结合的产物，可用于对受多个变量影响的响应值进行建模和分析，最终目的为优化该响应值。响应面法的特点和优势是通过设计合理的有限次数试验，建立一个包括各显著因素的一次项平方项和任何两个因素之间的一级交互作用项的数学模型，从而拟合出因素与响应值间的全局函数关系，有助于快速建模，缩短优化时间和提高应用可信度。然后通过对函数响应面和等高线的分析，对影响响应值的各因素水平及其交互作用进行优化和评价，快速有效地确定多因素系统的最佳条件[5]。本试验运用响应面法对影响甲硝唑-β-环糊精包合物制备工艺的主要因素进行考察与优化，并探索其对提高甲硝唑水溶性、化学稳定性等方面的影响。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

甲硝唑原料和甲硝唑对照品(批号：101910-201507，株洲远成合中科技发展有限公司)；β-环糊精(国药集团化学试剂有限公司)；其他常规试剂均为分析纯，购至国药试剂公司。

1.2仪器与设备

TU-1950型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；E103型生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)；HDM-500D型数显搅拌电热套(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)。

1.3试验方法

1.3.1包合物的制备精密称取β-环糊精处方量，置于100 mL的烧杯中，加入蒸馏水适量并轻微搅拌使成β-环糊精的饱和溶液[6]。将含有磁子的烧杯置于电热套中低速搅拌并加热至规定温度。将20 mL无水乙醇加热至50 ℃，精密称取处方量甲硝唑并加至无水乙醇中，待甲硝唑完全溶解后，逐滴缓慢加入到上述β-环糊精饱和溶液中，并调整至适当转速。搅拌至规定时间后，将烧杯连同试液置于冰箱中冷藏18 h，抽滤后用0.01 mol/L盐酸溶液立即冲洗3遍以除去未被包合的甲硝唑。将抽滤获得的沉淀物置于60℃真空干燥箱中干燥3 h，即得甲硝唑-β-环糊精包合物。

1.3.2包合率的计算将制得的甲硝唑-β-环糊精包合物置于研钵中，用研杵研磨成粉末状后，过120目筛网，精密称取研碎后的粉末10.0 mg置于25 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液定容、摇匀，待加入的包合物粉末全部溶解后，用0.1 mol/L盐酸溶液作为空白对照，在267.50 nm波长处测量溶液的吸光度[7-8]，把测定结果代入回归曲线，以计算所制包合物中甲硝唑的含量和甲硝唑包合率。

1.3.3试验方法分别考察包合温度、β-环糊精-甲硝唑摩尔比和包合时间三个因素对包合物制备产生的影响，并以包合率作为评价指标进行单因素试验和响应面法优化。

1.3.4包合物的显微鉴别取适量甲硝唑、β-环糊精、甲硝唑和β-环糊精混合物、甲硝唑-β-环糊精包合物分别溶于60℃的水溶液中使成饱和溶液，待完全溶解后在室温条件下进行自然降温，冷却至室温后溶液中形成的晶体经过滤、干燥、制片后置于显微镜下观察结晶的形态[9]。

2　结果与分析

2.1含量检测方法学

精密称取甲硝唑对照品10 mg于100 mL的容量瓶中，再加入0.1 mol/L 盐酸溶液溶解并定容，摇匀后作为标准溶液备用。精密量取上述标准液5.0 mL置于50 ml容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液定容并摇匀作为测试液；用0.1mol/L盐酸溶液作为空白对照，按照分光光度法在200～400 nm范围内扫描，结果表明甲硝唑在276.50 nm处有最大紫外吸收，而环糊精辅料在此波长处对测定无干扰。精密量取上述标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于25 mL容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液定容，在276.50 nm波长处测定溶液的吸光度，以浓度对吸光度进行线性回归所得回归方程为：Abs=0.03277C+0.00395，r=0.9999。由此可见在所涉及到的甲硝唑溶液浓度范围内线性关系较好[10]，实验精密度、稳定性和回收率实验符合要求。

2.2单因素试验结果

2.2.1包合温度对甲硝唑包合率的影响取甲硝唑0.79 g，β-环糊精-甲硝唑摩尔比1 ∶1，包合时间1.5 h，中包合物制备方法进行制备。考察不同包合温度对甲硝唑包合率的影响，结果见图1。由图1可知，在温度25～45 ℃之间时，甲硝唑的包合率随温度的升高而增加，而温度继续升高超过45 ℃时包合率开始逐渐下降，因此包合温度选取45 ℃较为适宜。

图1　温度对包合物包合率的影响

图2　摩尔比对包合物包合率的影响

2.2.2摩尔比对甲硝唑包合率的影响将包合温度设为45 ℃，包合时间为1.5 h，按包合物制备方法进行制备。考察不同的β-环糊精-甲硝唑摩尔比对甲硝唑包合率的影响，结果见图2。由图2可知，在β-环糊精-甲硝唑摩尔比由1 ∶2增加到5 ∶4的过程中，甲硝唑的包合率逐渐增加，而在β-环糊精-甲硝唑摩尔比超过5 ∶4之后，包合率开始明显降低，因此β-环糊精-甲硝唑摩尔比选取5 ∶4较为适宜。

2.2.3包合时间对甲硝唑包合率的影响取甲硝唑0.79 g，β-环糊精-甲硝唑摩尔比5 ∶4，包合温度为45℃，按包合物制备方法进行制备。考察不同包合温度对甲硝唑包合率的影响，结果见图3。由图3可知，随着包合时间的延长，甲硝唑的包合率显著增加，而当时间超过1.5 h后，包合率则会缓慢下降，因此包合时间选取1.5 h较为适宜。

图3　包合时间对包合物包合率的影响

2.3响应面法优化制备工艺试验及分析

2.3.1数据模型的建立以单因素试验结果作为基础，选择包合温度、β-环糊精-甲硝唑摩尔比和包合时间三个因素作为考察对象，按照Box-Behnken的中心组合设计原理，采用响应面法按3因素3水平对甲硝唑-β-环糊精包合物制备工艺进行优化[11]。设计的因素及水平见表1，采用Design-Expert 8.0.5软件对试验因素进行设计并对所得的数据进行拟合分析，结果见表2。以包合率(Y)作为因变量，β-环糊精-甲硝唑摩尔比(A)、包合温度(B)、包合时间(C)为自变量。所建立的回归曲线方程为：

Y=-139.36+177.76*A+2.50*B+29.57*C+1.26*AB+12.42*AC+0.31*BC-95.36*A2-0.05*B2-16.80*C2

表1　响应面法因素水平试验设计

表2　响应面分析试验设计及结果

表3　回归方程的方差分析

注：*** 表示差异极显著(<0.001)；** 表示差异高度显著(<0.01)；* 表示差异显著(<0.05)。

根据表3能够得出，考察因素对甲硝唑包合率产生影响程度的次序为：C>A>B，即包合时间>β-环糊精-甲硝唑摩尔比>包合温度。由方差分析得出的数据可知，该模型的p<0.0001，模型极显著。失拟项p= 0.3255> 0.05，较正相关系数平方R2= 0.9130，可说明此模型和实际拟合程度的误差比较小且能够用于分析与预测β-环糊精包合甲硝唑的工艺水平。因此可认为以上所得二次回归方程模型较为合适。

2.3.2响应曲面分析在对模型的响应曲面和其对应的等高线图进行分析之后，能够得知影响因素之间的交互作用及其对于包合率的作用情况。对最佳条件进行预测和验证即可得知甲硝唑包合物制备的最优工艺条件。所建立模型的响应曲面及其等高线图见图4-6。

图4　包合温度与摩尔比对药物包合率的交互影响

图5　包合时间与包合温度对药物包合率的交互影响

通过对甲硝唑包合物制备工艺条件进一步优化所得的最优工艺条件为：A=1.38，B=49.32，C=1.85，即所得最优工艺为：β-环糊精/甲硝唑摩尔比为1.38，包合温度为49.32℃，包合时间为1.85 h。在此条件下模型预测包合率最优结果为72.10%；为便于实际操作对此工艺进行适当调节，取β-环糊精/甲硝唑摩尔比为1.4，包合温度为49 ℃，包合时间为1.85 h。在此条件下进行3次验证试验，试验所得包合率均值为72.54 %，与预测的数据相差0.61%，能够证明回归模型拟合结果较好。预测结果与实际试验结果基本没有差异，回归方程在实际应用中可显示各个因素的作用。所以运用响应面法优化甲硝唑-β-环糊精包合物制备工艺是可行的。

2.4包合物的稳定性考察

取甲硝唑原料药适量，精密称定，再称取相当量的甲硝唑-β-环糊精包合物，分别倒入相同的试管中后，暴露于日光条件下放置5 d，并详细记录。可观察到试管中甲硝唑原料药颜色明显变黄，而甲硝唑-β-环糊精包合物的颜色并未发生明显的变化。

分别称取甲硝唑原料药和甲硝唑-β-环糊精包合物10 mg于100 ml的容量瓶中，加水溶解并定容。置于室温条件下，然后分别在第0、1、2、3、4、5、6 d测定吸光度，计算溶液中药物的含量变化情况。所得结果见图7，从图中可知将甲硝唑包合于β-环糊精后稳定性可大大提高。

图7　甲硝唑、甲硝唑-β-环糊精包合物稳定性结果

2.5溶解度测定与结果

称取甲硝唑与制得的甲硝唑-β-环糊精包合物5 mg分别置于100 mL量筒中，于25 ℃条件下逐滴滴加蒸馏水，每隔5 min强力振摇30 s；观察30 min内的溶解情况，直至无目视可见的溶质颗粒[12]。测定结果表明甲硝唑经β-环糊精包合后其水溶性是未经包合的2.18倍。

2.6包合物的显微鉴别

按1.3.4中鉴别方法对所制备包合物进行显微鉴别，结果见图8。从图中可以看出，甲硝唑、β-环糊精、甲硝唑和β-环糊精混合物经过重结晶后其晶体分别呈长针形、方块形、长针形与方块形的混合且颜色较浅几乎透明，可知两者的简单混合并未发生相互作用，而甲硝唑-β-环糊精包合物经重结晶后呈无规则块状、颜色较深，与其它三者明显不同，生成了新的产物，即甲硝唑-β-环糊精包合物。

图8　各组分的显微结晶图(a: MNZ; b: β-CD; c: MNZ 与β-CD; d: MNZ-β-CD 包合物)

3　结论与讨论

关于响应面法优化硝唑类药物环糊精包合物制备工艺的报道多有涉及，但未发现优化甲硝唑包合物的报道[13]。本试验运用响应面法对影响甲硝唑-β-环糊精包合物制备工艺的关键因素进行了考察和优化，对所制备的包合物进行鉴别，发现将甲硝唑制成包合物后可明显提升其稳定性，这些结果将有利于甲硝唑制剂的生产和临床应用。

在多数与甲硝唑结构类似药物包合物包合工艺优化过程中，当搅拌速度调节至一定范围内时其对包合工艺的产生的影响几乎可以忽略，如邹国省等用响应面设计法优化替硝唑环糊精包合物的制备工艺[14]；伍永富等Box-Behnken设计-效应面法优化木犀草素-β-环糊精包合物的制备工艺[15]。而且由于实验室中现有搅拌电热套功能条件的限制，所以在本试验中将搅拌速度调节统一至一定转速后没有继续考察搅拌速度对甲硝唑包合率的影响。

通过响应面法优化甲硝唑-β-环糊精包合物制备工艺所得的最佳条件能有效提高包合物中甲硝唑的包合率，明显改善甲硝唑的水溶性和稳定性，并为其制剂的工业化生产及临床应用提供了一定依据。

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(责任编辑：马世堂)

Optimization of Preparation Technology and Quality Evaluation of Metronidazole -beta- Cyclodextrin Inclusion Compound

PAN Ru-jin

(Pharmacy Department, Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine , Nanjing 210029, China)

Objective: To optimize the preparation technology of MNZ-β-CD inclusion compound according to the characteristics of β-CD, and to explore its effect on improving the water solubility, chemical stability and so on. Method: the inclusion compound was prepared by the method of saturated aqueous solution, and the entrapment efficiency of inclusion compound was used as the evaluation index, and the method of response surface design was used to optimize the preparation process. Result: the optimal processing parameters were: 49 ℃, the mixing time=1.85 h, β-CD ∶MNZ=1.4 ∶1, the entrapment efficiency of inclusion compound was 72.54%. Conclusion: The adopted model was reasonable and effective. The physical and chemical properties of MNZ-β-CD inclusion compound were optimized by Box-Behnken surface response design method which was stable.

Metronidazole; Response surface method; Cyclodextrin; Inclusion compound; Quality evaluation

2016-04-01

江苏省中医药局基金项目(LZ13061)。

潘如金(1969-)，男，江苏省南京市人，主管药师，主要从事中药学研究。

R944

A

1673-8772(2016)04-0035-07