UPLC-MS/MS同时测定水质中诺氟沙星和氧氟沙星

周桂萍

（广东产品质量监督检验研究院，广东 广州 510330）

UPLC-MS/MS同时测定水质中诺氟沙星和氧氟沙星

周桂萍

（广东产品质量监督检验研究院，广东 广州 510330）

建立了超高效液相色谱―串联质谱/质谱法（HPLC-MS/MS）同时测定水质中诺氟沙星和氧氟沙星的分析方法。试样经HLB柱净化和C18柱分离，采用电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，多反应监测（MRM）模式进行检测，外标法定量。结果表明，诺氟沙星和氧氟沙星在2～100 μg/L 浓度范围内线性关系良好，空白样品加标回收率均大于85%，相对标准偏差小于10%，诺氟沙星和氧氟沙星方法检出限（LOD）均为0.5 ng/mL，定量限为2 ng/mL。该方法准确、灵敏、操作相对简便，适用于同时测定水质中诺氟沙星和氧氟沙星。

超高效液相色谱―串联质谱/质谱法；水质；诺氟沙星；氧氟沙星

因此，本文建立固相萃取―超高效液相色谱―串联质谱法同时测定水质中氧氟沙星和诺氟沙星，具有灵敏度高、定性能力强等优点，应用于实际样品检测，结果令人满意。

1　实验

1.1试剂与仪器

诺氟沙星标准品，纯度大于99%，德国Dr. Ehrenstorfer公司；氧氟沙星标准品，纯度大于99%，德国Dr. Ehrenstorfer公司；甲酸，优级纯，德国CNW公司；氮气，纯度大于99.999 %；超纯水，18.2 MΩ。ACQUITYTM超高效液相色谱和Waters XevoTMTQ MS 三重四极杆串联质谱仪，美国Waters公司；Milli-Q去离子水发生器，美国Millipore公司；Oasis HLB固相萃取柱，60 mg/3 mL，Waters公司；HLB固相萃取柱活化使用前均依次用6 mL甲醇、6 mL水活化。

1.2标准溶液配制

称取氧氟沙星和诺氟沙星标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解配制成浓度为100 mg/L的储备液。再用初始流动相逐级稀释配制2、10、25、50、75、100 μg/L标准工作溶液，现配现用。

1.3HPLC-MS/MS检测条件

色谱柱Shim-pack XR-ODS3 C18（75×2.0 mm，1.6 μm），柱温40℃，流速0.2 mL/min，样品室温度15℃，流动相A：0.1%甲酸―乙腈，流动相B：0.1%甲酸―水，进样体积10 μL。

梯度洗脱程序：0～6 min，10%～60%A；6～11 min，60%A，保持5 min；11～11.1 min，60%～10%A。质谱条件：电喷雾离子源（ESI），源温度150℃，正离子扫描模和多反应监测（MRM）模式，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流量550 L/h，碰撞气流量0.13 mL/min，毛细管电压2.82 kV。

1.4样品前处理

取水样50 mL，过HLB柱净化，样品全部过柱后，抽干，用5 mL甲醇洗脱，35℃水浴氮气吹至近干，加入1.0 mL0.2%甲酸―水溶液溶解，过0.45 μm滤膜，供液相色谱―串联质谱检测。

2　结果与讨论

2.1色谱条件优化

诺氟沙星和氧氟沙星属于氟喹诺酮类抗生素，分子结构式中含有哌嗪基和羧基，属于酸碱两性化合物，结构中的羧基团和叔胺基能在水中发生解离，液相色谱分析时易发生色谱峰拖尾现象，因固定相表面的活性位点（游离的硅醇基）可通过氢键等强烈吸附氧氟沙星和诺氟沙星。为保证待测物在流动相中的稳定溶解状态，本研究比较了在乙腈与3 mmol/L 乙酸铵、0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.3%甲酸等挥发性酸或挥发性盐对待测物色谱行为的影响。结果表明，以0.1%甲酸水溶液―0.1%甲酸―乙腈为流动相，采用梯度洗脱方式可获得最优的质谱信号响应，待测物虽然没有完全分离，但并不影响定性定量。

2.2流量条件的选择

对流量的选择，对比了在0.2 mL/min～0.5 mL/min 流量范围内，诺氟沙星和氧氟沙星的质谱信号响应及色谱分离效果。结果表明，UPLC 在0.2 mL/min 流量下，分离效果、质谱响应值、色谱柱的柱压以及分析时间均比较理想。

2.3质谱测定条件的优化

首先以流动注射的方式将1 mg/L 的诺氟沙星标准溶液在质谱正离子模式下进行母离子全扫描，确定分子离子，然后分别以分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描。由于诺氟沙星含有羧基和哌嗪结构，在0.1%甲酸水溶液―0.1%甲酸―乙腈流动相条件下，容易获得[M+H]+准分子离子，通过改变碰撞能力和锥孔电压，对准分子离子碰撞，获取子离子，定量离子选择为丰度最强的碎片离子，定性离子选择为次强碎片离子，获得的最佳质谱条件如表1所示。

表1　氧氟沙星和诺氟沙星保留时间及质谱检测参数

2.4净化条件的优化

诺氟沙星和氧氟沙星属于酸碱两性化合物，具有较高的极性，能在水中发生解离。SPE柱中 HLB柱反相吸附剂具有亲水亲脂性且水可浸润，是中性、酸性及碱性化合物的通用型小柱；WAX柱反相吸附剂为混合型弱阴离子，对强酸性化合物选择性好。对比分析了 HLB柱和 WAX柱萃取效率，结果发现，HLB柱萃取效率较好，对诺氟沙星和氧氟沙星回收率为85.2%～89.4%，而 WAX柱平均回收率为55.2%～65.0%。实验结果如表2所示，因此，本实验采用HLB固相萃取柱作为样品净化柱。

表2　诺氟沙星和氧氟沙星回收率和相对标准偏差（RSD）（n＝6）

2.5线性范围和检出限

基质效应表现为对待测物的信号起抑制或增强作用，直接影响检测结果的准确性。按照Matuszew ski等建立的数学模型，采用空白基质提取后添加标准品的方法，考察基质效应的影响。实验结果表明，经HLB柱净化后，诺氟沙星和氧氟沙星未受到基质抑制影响。

诺氟沙星和氧氟沙星在2～100 μg/L浓度范围内线性相关性好，相关系数0.998。以阴性水质样品作为本底，采用加标的方式考察方法的定量限（LOQ）和检出限（LOD）。结果表明，诺氟沙星和氧氟沙星在水质中的检出限（S/N≥3）为0.5 ng/mL，定量限（S/N≥10）为2 ng/mL。

2.6方法回收率与精密度

选择不含待测物的水质样品分别添加2、5、10 μg/L标准品，按照“1.4”方法进行测定，分别平行测定6次，回收率及相对标准偏差列于表3。诺氟沙星和氧氟沙星的回收率84.8%～94.1%，相对标准偏差RSD为5.8%～7.9%，准确度和精密度好。

表3　诺氟沙星和氧氟沙星添加回收率和精密度（n＝6）

图1a、图1b分别为诺氟沙星空白样品与空白样品加标（5 μg/L）的提取离子色谱图，图2a、图2b分别为氧氟沙星空白样品与空白样品加标（5 μg/L）的提取离子色谱图，由图1、图2可见目标物未受到杂质干扰。

图1　诺氟沙星空白样品（a）和样品加标5 ng/mL（b）的MRM色谱图

图2　氧氟沙星空白样品（a）和样品加标5 ng/mL（b）的MRM色谱图

2.7实际样品检测

采用本方法对抽取的不同河涌各20份水质样品进行检测，同时作质控样品。质控样品的回收率等指标均达到分析要求，13份水质样品均检出诺氟沙星和氧氟沙星，诺氟沙星含量在15～64 ng/L，氧氟沙星含量在10～97 ng/L。

3　结论

建立了固相萃取―高效液相色谱―串联质谱法同时测定水质中诺氟沙星和氧氟沙星的分析方法，方法灵敏度高、重现性好。样品前处理简单快速，净化除杂效果好，有效降低基质干扰，回收率高，适用于水质中诺氟沙星和氧氟沙星的定量检测与定性确证。

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Determination of Norfloxacin and Ofloxacin in Water Using UPLC-MS/MS

ZHOUgui-ping
（Guangdong Testing Institute for Product Quality Supervision,guangzhou 510330, China）

An solid phase extraction and ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was established for the determination of Norfloxacin and Ofloxacin in water. The sample purified by HLB SPE column, and was separated on a reversed phase column by acetonitrile (containing 0.1% formic acid) and 0.1% formic acid solution and then detected by positive electrospray ionization under multiple reaction monitoring (MRM) mode and liquid chromatography tandem mass spectrometry and then detected by UPLC-MS/MS under electrospray ionization, positive ion scan, multiple reaction monitoring (MRM) mode, fixed quantity with external standard. The results showed that Norfloxacin and Ofloxacin at 2～100 μg/L concentration ranged agood linear relationship, blank samples spike drecoveries weregreater than 85%, the relative standard deviation was less than 10%. Norfloxacin and Ofloxacin method detection limits (LOD) were all 0.5 ng/mL and 2 ng/mL, respectively. The method wasaccurate, sensitive, and the operation was relatively simple and effective to reduce matrix interference, suitable for determination of Norfloxacin and Ofloxacin in water.

UPLC-MS/MS; water; Norfloxacin; Ofloxacin

O657.71; O657.8

A

1009-220X(2016)02-0037-06 DOI: 10.16560/j.cnki.gzhx.20160218诺氟沙星（Norfloxacin）和氧氟沙星（Ofloxacin）属于氟喹诺酮类药物。近年来，氟喹诺酮类药物因有吸收好、血液浓度高、抗菌谱广、半衰期长、能迅速分解到各组织等特点，在临床和畜牧业中得到迅速推广，成为用途广泛、十分重要的抗生素[1]。据报道，仅2005年，我国生产抗生素约21万吨，其中作为兽药使用就有9万吨[2]。这些药物使用后经不同途径进入环境，从而可能引发一系列问题，如细菌耐药性等。目前在生活污水[3-4]、饮用水[5-6]、河流底泥、污泥[7-10]和土壤等多种环境中检出了抗生素类药物残留[11]。国内外对氧氟沙星和诺氟沙星的检测方法主要有免疫法、分光光度法、荧光分析法、化学发光分析法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学分析法等[12-19]。这些方法存在一定的优点，但都有定性能力差，检出限高等不足，难以满足水体中痕量抗生素的定性定量检测。

2016-02-29

周桂萍（1984～），女，硕士学位，工程师；主要从事质量管理与检测技术研发。274257802 @qq.com