IL-23诱导人外周血单个核细胞增殖及其体外杀伤MUTZ-1细胞的实验研究

2016-10-18王瑞仓刘艳芬杨洁周洁李杰郝洪岭

河北医药 2016年20期

关键词：靶细胞阴性诱导

王瑞仓　刘艳芬　杨洁　周洁　李杰　郝洪岭

·论著·

IL-23诱导人外周血单个核细胞增殖及其体外杀伤MUTZ-1细胞的实验研究

王瑞仓刘艳芬杨洁周洁李杰郝洪岭

IL-23；MUTZ-1细胞；杀瘤活性

骨髓增生异常综合征(MDS)是一种起源于造血干细胞的克隆性疾病，以病态或无效造血、一系或多系血细胞质/量异常、易进展为急性髓系白血病为特征，患者生存期短[1,2]。目前临床治疗MDS主要采用化疗、靶向治疗、诱导分化治疗等，但疗效均不甚满意，原因主要在于这些方法不能杀灭所有肿瘤细胞，患者极易复发[3]。近年来，随着现代生物技术的发展和对机体免疫功能认识的不断深入，免疫疗法已经成为治疗血液肿瘤的重要手段。研究显示，IL-12是调节细胞免疫应答的关键因子，能够激活T细胞、NK细胞，并促进IFN-γ分泌，且无严重毒副反应，其中IL-23是IL-12家族的重要成员，主要发挥抗肿瘤及抗肿瘤转移作用[4]。然而，有关IL-23应用于MDS治疗的报道尚少。本研究旨在探讨IL-23诱导正常人外周血单个核细胞(PBMNC)对MDS细胞系MUTZ-1的杀瘤效应及作用机制，以期为MDS的免疫治疗提供理论依据和实验基础。

1　材料与方法

1.1药物与试剂MUTZ-1细胞购自北京协和细胞库；重组人IL-23购自美国R&D公司；人淋巴细胞分离液购自武汉博士德生物工程有限公司；RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；IFN-γ、TNF-α、TGF-β、颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素一抗购自美国Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒购自日本Takara公司；Trizol、实时荧光定量试剂盒购自美国Promega公司；细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2仪器倒置显微镜购自日本Nicon公司；Chemi DocTM XRS+化学发光凝胶成像系统购自美国Biorad公司；7300型Real time-PCR扩增仪购自美国ABI公司。

1.3实验方法

1.3.1MUTZ-1的培养:MUTZ-1加入含10%FBS的RPMI 1640培养基，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下常规培养MUTZ-1细胞，每2～3天传代一次。

1.3.2PBMNC的分离、培养及分组:采集健康人清晨空腹静脉血5 ml，肝素抗凝，PBS 1∶1稀释，采用Ficoll密度梯度离心法分离得到PBMNC，加入含10% FBS的RPMI 1640培养基，于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下常规培养。细胞分4组：阴性对照组(PBMNC培养基中未加IL-23)，3个浓度IL-23组(PBMNC培养基中分别加入2、10、50 ng/ml IL-23)，体外诱导72 h，并与MUTZ-1共培养。

1.3.4PBMNC杀瘤活性的测定:采用LDH释放法测定。取MUTZ-1细胞为靶细胞，加入含3%牛白蛋白无酚红的RPMI-1640 培养基，调整细胞密度为5×104/ml，PBMNC为效应细胞，按照20∶1效靶比将PBMNC和MUTZ-1细胞混合，同时设效应细胞、靶细胞自然释放组(50 μl效应细胞/靶细胞中加入50 μl RPMI 1640培养基)、靶细胞最大释放组(50 μl靶细胞中加入50 μl 1%NP-40)。于酶标仪490 nm波长处测D值，按照以下公式计算PBMNC杀瘤活性：杀伤率(%)=[试验组D值-靶细胞自然释放组D值]/[靶细胞最大释放孔D值-靶细胞自然释放孔D值]×100%。

1.3.5Real time-PCR:Trizol提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书加样进行逆转录反应，ABI 7300型荧光定量PCR仪扩增。引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用仪器自带的分析软件得到各样本、各基因扩增的Ct值，以GAPDH为内参照基因，目的基因表达相对值RQ=2-ΔΔCt。见表1。

表1　Real time-PCR引物序列及扩增产物长度

1.3.6Western-blot:提取细胞总蛋白，半干法电泳转移至PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭2 h。依次加入特异性一抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，化学发光法显色、定影。用UVP软件扫描测定蛋白条带IOD值，GAPDH作为内参照，以目的蛋白与GAPDH吸光度值的比值表示目的蛋白相对表达水平。

2　结果

2.1PBMNC细胞形态学观察及增殖情况IL-23组于培养第3天开始增殖，随着培养时间延长，细胞体积进一步变大，呈圆形。之后进入对数生长期，第7天细胞数量达峰值，其中50 ng/ml IL-23组PBMNC细胞数量较10 ng/ml IL-23组增多，后者较2 ng/ml IL-23组增多，3组增殖速度均大于阴性对照组(P<0.05)。见表2。